毛細管電泳法檢測糖化血紅蛋白的方法學性能評價

肖翔 鐘陽青 陳艷清 賈建 張偉龍 潘理想

【摘要】 目的：評價miniCAP Flex Piercing全自動毛細管電泳分析系統檢測糖化血紅蛋白（HbA1c）的方法學性能。方法：精密度評價按照美國臨床和實驗室標準化委員會（CLSI）頒布的EP15-A3文件的要求進行初步評價；分析測量范圍評價按照EP6-A2文件的要求進行；準確度評價使用EP9-A2文件，與高效液相色譜法檢測結果進行比對，并計算其在醫學決定水平處的偏倚；生物參考區間的驗證采用C28-A2文件的方案進行；收集異常高值和異常低值的新鮮標本進行攜帶污染率的評價；收集確診的異常血紅蛋白病患者的標本進行抗干擾能力的評價。結果：檢測系統檢測HbA1c濃度在4.50%和7.50%時的重復性精密度分別為1.14%、0.70%，期間精密度分別為1.80%、1.36%；當HbA1c濃度在3.6%～12.1%時檢測結果呈線性；與日本arkray公司的HA-8160高效液相色譜法檢測結果比較，回歸方程式為y=0.995x-0.177，線性相關系數R2=0.994，相關性較好，在醫學決定的水平10%、16%處的偏倚分別為-2.77%、-1.61%均小于5.0%；攜帶污染率為1.18%小于3.00%可接受；選取的20份健康參考個體，其HbA1c檢測結果均在3.6%～6.1%，參考區間可用；對廣東地區常見的血紅蛋白變異體HbE、HbS、HbC、HbD有良好的抗干擾能力。結論：毛細管電泳法檢測糖化血紅蛋白的精密度、準確度、分析測量范圍、攜帶污染率、生物參考區間均符合臨床檢測的需要，在抗血紅蛋白變異體的干擾能力上優于高效液相色譜法。

【關鍵詞】 毛細管電泳； 糖化血紅蛋白； 性能評估

【Abstract】 Objective：To evaluate the methodological performance of miniCAP Flex Piercing automatic capillary electrophoresis system for detection of glycosylated hemoglobin.Method：The precision of the evaluation according to the clinical and Laboratory Standards Committee （CLSI） issued by the EP15-A3 requirements analysis；measuring range was evaluated according to the EP6-A2 documents；accuracy evaluation method using the EP9-A2 file，detection results compare with high performance liquid chromatography；verify the biological reference intervals by C28-A2 file program；abnormal collection of high value and low value of the fresh specimens of abnormal carrying rate of pollution evaluation；evaluation of abnormal hemoglobin disease patients were collected specimens of anti jamming ability.Result：The repeatability accuracy of detecting HbA1c concentration at 4.50% and 7.50% respectively was 1.14% and 0.70%，the precision was 1.80% and 1.36% respectively.The results were linear when the concentration of HbA1c ranged from 3.6% to 12.1%；compared with the HA-8160 high performance liquid chromatography of arkray Company of Japan，the regression equation was as follows：y=0.995x-0.177，linear correlation coefficient R2=0.994，at the level of 10% and 16% of the medical decision，the bias was -2.77% and -1.61%，respectively，which was less than 5.0%；the carrying pollution rate of was 1.18%，which was less than 3.00% acceptable；the HbA1c test results of the 20 healthy reference individuals were all in the range of 3.6%-6.1%，and the reference range was available；it has good anti-interference ability to the common hemoglobin variant HbE，HbS，HbC，HbD in Guangdong area.Conclusion：The analysis performance of miniCAP HbA1c determination system meets the requirements of routine clinical application，the interference ability of hemoglobin variant is better than that of high performance liquid chromatography.

【Key words】 Capillary electrophoresis； Glycosylated hemoglobin； Performance evaluation

First-authors address：Tangxia Hospital of Dongguan City，Dongguan 523722，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.11.033

糖化血紅蛋白是血紅蛋白與血糖進行不可逆的非酶促反應的產物，可以反映近2～3個月血糖的水平，是判斷糖尿病長期控制的良好指標，同時也與糖尿病并發癥相關[1-3]。糖化血紅蛋白檢測目前臨床上使用較多的為高相液相色譜法，該法具有操作簡單、快速、結果可靠等特點，但是對于血紅蛋白變異體的抗干擾能力較差[4-5]。廣東地區為珠蛋白生成障礙性貧血及血紅蛋白病的高發地區[6-8]，因此在選用檢測方法的時候需要綜合考慮。毛細管電泳法是一種重復性好、結果可靠且能識別血紅蛋白變異體的方法[9]。本研究通過精密度、準確度、分析測量范圍、抗干擾能力和生物參考區間等指標來評估毛細管電泳法糖化血紅蛋白檢測的方法學性能，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 日本arkray公司提供的配套校準品和質控品；法國sebia公司提供的配套定標品和校準品；收集2016年11月-2017年5月來東莞市塘廈醫院就診的通過毛細管血紅蛋白電泳檢測和基因分析確診為HbE、HbS、HbC、HbD等血紅蛋白病的患者EDTA標本，同時收集HbA1c各濃度的標本40份，濃度范圍分布毛細管電泳法廠家說明書申明的整個分析測量范圍。

1.2 儀器試劑 高效液相色譜法為日本arkray公司的HA-8160型儀器，使用配套試劑、定標液、質控品；毛細管電泳法為法國sebia公司的minicap Flex Piercing型分析儀（以下簡稱miniCAP），使用配套試劑、定標液、質控品。儀器使用嚴格按照廠家說明的要求進行操作、校準和維護保養。

1.3 方法

1.3.1 精密度 采用EP15-A3文件的規定進行[10]，即使用sebia公司提供的兩個濃度水平的質控品，每天測定1批，每批重復測定5次，連續測定5 d，通過統計分析計算重復性精密度和期間精密度，精密度以不精密度（CV%）表示，按照指南的要求CV<2.0%為可接受。

1.3.2 準確度 采用EP9-A2文件的規定進行[11]，即每天選擇分布在廠家聲明的整個分析測量范圍內的標本8例，首選在HA-8160上檢測兩次，然后在2 h內使用miniCAP檢測兩次，連續5 d。通過回歸分析，建立數學模型，計算在醫學決定水平處的偏移。以偏倚小于1/2允許總誤差（5%）為可接受。

1.3.3 分析測量范圍 采用EP6-A3文件的規定進行[12]，即選擇高（H）、低（L）兩個濃度水平的標本，按照5L、4L+H、3L+2H、2L+3H、L+4H、5H的比例進行混合，制配實驗樣品，將實驗樣品按照隨機順序上機檢測，每個樣品重復測試2次，順序為隨機放置，避免攜帶污染的影響，通過線性擬合，得出最佳線性方程y=ax+b，方程式的斜率a在0.97～1.03，截距b與0無統計學差異，線性相關系數r>0.95，為可接受。

1.3.4 抗干擾能力 選擇經過毛細管血紅蛋白電泳篩選的各種血紅蛋白變異體標本，采用地貧基因分型方法加以確診，本次實驗收集到HbE、HbS、HbC、HbD四種類型的血紅蛋白變異體，其血紅蛋白變異體的含量分別為12.6%、8.4%、3.2%、4.8%；實驗樣品上機檢測，同時使用正常人的標本與其進行1∶1的混合，混合樣品上機檢測，計算混合樣品測定值與預期值得偏倚，偏倚小于5.0%為可接受。

1.3.5 攜帶污染率 選擇HbA1c濃度為12.1%和3.6%的高值和較低值標本各1份，首先連續測定高值標本3次（H1、H2、H3），隨后立即連續測定低值標本3次（L1、L2、L3），記錄所有數據，按下列公式計算：攜帶污染率=（L1-L3）/（H3-L3）×100%，攜帶污染率CV<3.0%為可接受。

1.3.6 生物參考區間 采用C28-A2文件的規定進行[13]，通過制定健康狀況調查表，輔以血糖、血常規、血紅蛋白電泳等檢測結果，選取20個健康參考個體為自愿者，參與實驗的自愿者統一在次日上午10：00抽取靜脈EDTA抗凝血標本1 mL，在2 h內上機檢測。采用“1/3”規則進行離群值檢驗，剔除離群值，并用新的參考個體代替。若20份標本中不超過2份標本的檢測值超出參考區間，則表明現行的參考區間可以接受。

1.4 統計學處理 所有數據均采用SPSS 19.0軟件進行統計分析和處理，計量資料以（x±s）表示，相關性分析采用線性回歸分析。

2 結果

2.1 精密度驗證結果 使用sebia公司提供的兩個濃度水平的質控品，每天測定1批，每批重復測定5次，連續測定5 d。質控品的HbA1c濃度均值分別為4.5%和7.5%，分析系統在這兩個濃度水平處的重復性精密度分別為1.14%和0.70%，期間精密度分別為1.80%和1.36%，結果均小于2.0%，分析系統精密度可接受，見表1。

2.2 準確度 選擇HbA1c濃度分布整個廠家申明的分析測量范圍的標本40份與HA-8160分析儀進行比對，通過離群點檢測，未發現離群點，得出回歸方程式為y=0.995x-0.177，相關系數R2=0.994，線性相關性較好，見圖1。糖化血紅蛋白的醫學決定水平為10%和16%，將兩者代入方程式，偏倚分別為-2.27%和-1.61%，均小于5.0%，結果可接受。

2.3 分析測量范圍 選擇3.6%和12.1%兩個濃度的樣本進行比例混合，按照EP6-A2文件的規定執行，通過統計學分析回歸方程式最佳擬合曲線為一元一次方程，方程式為y=1.016x-0.133，線性相關系數R2=0.999，滿足斜率a在0.97～1.03，截距b與0無差異，線性相關系數r>0.95的要求，故判斷miniCAP毛細管電泳法糖化血紅蛋白檢測在3.6%～12.1%檢測結果呈線性，見圖2。

2.4 抗干擾能力 HbE、HbC、HbD、HbS四種血紅蛋白變異體在毛細管電泳中被清晰的分離出；四種變異體的HbA1c濃度分別為5.6%、6.3%、4.7%、8.6%。選擇糖化血紅蛋白正常的標本（HbA1c濃度為5.5%）與變異體標本1∶1混合后上機檢測，計算理論值與實測值得的偏倚。四種變異體標本的偏倚分別為2.70%、3.39%、3.92%、-2.13%，偏倚均小于5.0%，判斷結果可接受，故認為常見的血紅蛋白變異體（HbE、HbC、HbD、HbS）對HbA1c的檢測無影響。見表2。

2.5 攜帶污染率 選擇HbA1c濃度為12.1%的高值標本和3.6%的低值標本各1份，首先連續測定高值標本3次（H1、H2、H3），隨后立即連續測定低值標本3次（L1、L2、L3），記錄所有數據，按下列公式計算：攜帶污染率=（L1-L3）/（H3-L3）×100%。結果攜帶污染率為1.18%，小于3.00%，可接受。

2.6 生物參考區間 通過制定健康狀況調查表、輔以血糖、血常規、血紅蛋白電泳檢測等各種檢查，選取20例健康參考個體，每個健康參考個體都在次日上午10：00之前抽取靜脈EDTA抗凝標本1 mL，在2 h內上機檢測，收集結果，統計檢測結果超出參考區間的標本個數，結果20份健康檢查者的HbA1c結果均在3.6%～6.1%，生物參考區間符合要求。

3 討論

糖化血紅蛋白是紅細胞內血紅蛋白與葡萄糖長期接觸后發生的一種不可逆的非酶促反應，其可反映人體2～3個月的平均血糖水平，不僅是WHO推薦的糖尿病診斷標準，也是糖尿病血糖控制目標，以及評價糖尿病治療方案有效性的指標[14]。

目前臨床實驗室普遍采用的HbA1c測定方法有多種，按原理可分為兩大類：一類是基于糖化與非糖化血紅蛋白所帶電荷的不同，如離子交換層析法、電泳法；另一類是基于糖化與非糖化血紅蛋白結構的不同，如免疫法、親和層析法及酶法等。不同方法采用的原理不同，所測組分不同，如離子交換色譜法測定HbA1c，親和層析法測定總糖化血紅蛋白（GHb）[15]。隨著研究的深入糖化血紅蛋白在疾病的診斷和預后判斷等方面應用日益廣泛，因此對糖化血紅蛋白的測定的精密度和準確度提出了很高的要求。依據臨床實驗室管理辦法和醫學實驗室質量和能力認可準則（ISO15189）的要求[16]，新的檢測系統在用于臨床檢測之前需要對其性能進行驗證，驗證指標至少需要包括精密度、準確度、分析測量范圍和生物參考區間。對于HbA1c的檢測是檢測其占血紅蛋白的比例，因此排除異常血紅蛋白的影響也在考慮范圍之內。異常血紅蛋白可引起異常血紅蛋白病，是瘧疾高發地區常見的遺傳性疾病，其血紅蛋白變異體對目前臨床常用糖化血紅蛋白檢測方法有一定的干擾[4]，廣東作為該病的高發地區，實驗室在選擇HbA1c的測定方法是應該綜合考慮該因素。毛細管電泳法糖化血紅蛋白檢測方法是sebia公司研發的一種新型檢測方法，有研究報道其具有良好的精密度、準度和抗異常血紅蛋白的干擾能力[2]，還能對異常血紅蛋白有提示作用[17-18]。筆者所在科引進該檢測系統在投入臨床檢測之前按照相關規定對其分析能力進行評估。

本研究采用EP1-A3方案對毛細管電泳檢測系統進行精密度的初步評估，得出在4.50%和7.50%濃度水平處時的重復性精密度分別為1.14%、0.70%，期間精密度為1.80%、1.36%，按照sebia廠家的聲明不精密度CV小于3.0%為合格，按照糖化血紅蛋白檢測指南的要求CV小于2.0%為宜，本次驗證結果均小于2.0%，與徐安平等[2]的研究結果相似，故檢測系統的精密度符合臨床檢測的要求。準確度評價采用EP9-A2文件的要求與HA-8160高效液相色譜法檢測結果進行比較，其線性相關性較好，在醫學決定水平10%、16%處的偏倚分別為-2.27%和-1.61%，均小于5.0%，與羅燕芬等[19]的研究結果相似，準確度符合臨床檢測的要求。分析測量范圍評價使用EP6-A2文件的要求對檢測系統的分析測量范圍進行評估，結果在3.6%～12.1%時檢測結果呈線性，分析測量范圍評價的上限未到達廠家申明的上限，且與陳喬彬等[20]報道的可以在4.4%～18.3%呈線性比較，上限范圍較窄，這是因為在評估過程中沒有找到更高濃度水平的標本故未能評估檢測系統的整個分析測量范圍，在以后的工作中遇到高值標本隨時進行評估。收集到通過毛細管血紅蛋白電泳和基因分型確診為血紅蛋白HbE、HbC、HbD、HbS四種血紅蛋白變異體各一份，使用正常標本對其進行1∶1稀釋后檢測結果與預期值的偏倚分別為2.70%、3.39%、3.92%、-2.13%，該結果大于重復性精密度，分析原因可能存在稀釋變異，但是其結果小于5.0%，故判斷結果可接受，即上述四種血紅蛋白變異體對毛細管糖化血紅蛋白檢測結果無影響。分析系統的攜帶污染率為1.18%，大于本次實驗得出的重復性精密度，大于羅燕芬等[19]0.99%，可能原因為高值標本和低值標本的HbA1c濃度差異不大引起，低值標本重復三次的結果為3.6%、3.6%、3.5%，高值標本為12.1%、12.1%、12.2%，按照公式計算時分子已經很小了，但是分每從理論上已經決定了其不會太大，故造成結果偏高，但是其小于相關文件的規定的3.0%，故認為結果可接受。生物參考區間是解釋檢測結果的標尺，故對其的評價至關重要，而參考區間的評價選擇健康參考個體是關鍵，本次實驗使用C28-A2文件的要求，通過查閱文獻和相關指南、共識制定健康狀況調查表，并對初步篩選處的參考個體進行血糖、血常規、血紅蛋白電泳等檢測，最后選出符合規定的20個健康參考個體，在次日上午10：00之前抽取1 mL EDTA抗凝全血，進行糖化血紅蛋白分析，結果20份標本的檢測結果全在3.6%～6.1%，生物參考區間滿足臨床檢測的需要。

綜上所述，毛細管電泳法糖化血紅蛋白檢測的精密度、準確度、分析測量范圍、攜帶污染率、對血紅蛋白變異體的抗干擾能力、生物參考區間等性能指標符合臨床檢測的需要，可以用于臨床標本的檢測。

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