神經干細胞提取及培養方法的體會

吳增，董賢慧，李媛，靳曉飛，周曉紅，高維娟△

神經干細胞（neural stem cells，NSCs）是神經系統的始祖細胞，具有自我更新與分化的能力，通過對稱性分裂產生兩個完全相同的NSCs，通過非對稱性分裂分化為其他細胞（神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞）。NSCs作為一種特殊的干細胞，具有獨特的生物學特性（分化性、遷移性、趨化性和低免疫原性），因此NSCs移植在治療神經系統疾病中具有良好前景。開展NSCs移植的前提是獲得活力和穩定性均較高的種子細胞，而NSCs較其他細胞更加脆弱，對外界環境的變化非常敏感，所以提取NSCs的技術操作應十分精細，并全面把控體外培養NSCs的影響因素。基于諸多研究者的培養經驗，本課題組經過長期實踐，篩選并建立了一套完善、實用、可靠的NSCs提取及體外培養方法，現報告如下。

1 主要材料和儀器

1.1 實驗動物 健康清潔級SD孕鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為SCXK（京）2016?0011。

1.2 主要試劑和儀器 主要試劑：DMEM/F?12（1∶1）、B?27、Accutase酶均購于Gibco公司；堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、表皮生長因子（EGF）均購于PeproTect公司；胎牛血清購于浙江天杭生物科技有限公司；胰蛋白酶購于北京索萊寶科技有限公司。主要儀器：3111型二氧化碳培養箱購于Thermo公司；SW?CJ?2FDSW?CJ?2FD潔凈工作臺購于蘇州安泰空氣技術有限公司；IX73型生物顯微鏡購于OLYMPUS公司；H2050R型離心機購于長沙湘儀離心機儀器有限公司。

2 神經干細胞的提取

2.1 提取步驟 取孕14 d SD大鼠1只，麻醉后將其浸泡于75%乙醇中0.5 h（僅露出頭部），然后用無菌器械取出子宮，將子宮置于75%乙醇中浸泡2 min。在潔凈工作臺內解剖子宮，將胎鼠置于預冷的D?Hank’s液中，迅速取出胎鼠雙側大腦皮質，置于含有D?Hank’s液的培養皿中，迅速用鑷子仔細剝除腦膜，轉移至含有培養基的培養皿中，眼科剪剪碎，用無菌吸管轉移到離心管內，以10～12次/min的頻率緩慢輕柔吹打含有腦組織的培養基（機械吹打法），吹打至無肉眼可見組織塊，以1 000 r/min離心5 min，去上清，加入NSCs無血清培養基，輕柔吹打成細胞懸液，先后過200目和500目細胞篩，細胞計數后以1×106個/mL密度接種，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，見圖1。

Fig.1 A good condition of the neurospheres(×400)圖1 狀態良好的神經球（×400）

2.2 提取要點

2.2.1 鼠齡的選擇 大鼠的NSCs于胚胎第12天開始出現，第14～15天達到高峰[1?3]。

2.2.2 無菌操作 原代細胞提取過程中保持無菌原則至關重要，且NSCs較其他細胞更脆弱，因此更需注意無菌操作。主要環節：保持操作環境無菌，取材室和細胞室紫外線消毒20 min；操作人員嚴格消毒程序，換滅菌鞋、換無菌衣、戴口罩、戴帽子、洗手、穿無菌手術衣；通過乙醇浸泡和紫外線照射兩種方法對實驗動物進行徹底滅菌；對所有取材器械進行高壓滅菌。

2.2.3 低溫與營養支持 在提取過程中，應保持NSCs處于低溫環境并給予營養支持。低溫是活體組織和離體細胞長期保存的一種有效方法，主要通過降低細胞代謝率來起到保護作用。實驗操作全程在冰板上進行，D?Hank’s液預冷，使腦組織處于低溫環境中，可以最大限度提高細胞的存活率。為保證細胞的存活率，在D?Hank’s液中剝除腦膜后應立即將腦組織轉移至培養基中，接種前便給予營養支持。

2.2.4 細胞分離方法 原代細胞分離常采用機械吹打和胰酶消化兩種方法。機械吹打法即提取步驟中所提及的方法。胰酶消化法：用無菌吸管將剪碎的大腦皮質轉移到離心管內，靜置2 min，去上清，加入1 mL 0.125%胰酶，消化10 min，加入培養基終止消化，以1 000 r/min離心5 min，去上清，加入培養基，輕柔吹打成細胞懸液，過細胞篩，細胞計數后接種。胰酶消化的時間很難控制，如果消化時間過長會導致消化后活細胞比例較低；胎鼠腦組織中細胞外基質和結締組織均較少，細胞間連接不緊密，取得大腦皮質后，用眼科剪剪碎，直接輕柔吹打即可，最后將細胞懸液用細胞篩過濾，可以得到高存活率的單細胞懸液。

2.2.5 細胞過篩 目的是最大限度將腦組織分離為單細胞，并去除未剝離干凈的腦膜。許多研究者在實驗中采用100目細胞篩（孔徑150 μm）[4]、200目細胞篩（孔徑75 μm）[5?6]、400目細胞篩（孔徑38 μm）[7]等不同孔徑的篩網。本課題組采用以上3個規格的細胞篩過濾后，在細胞培養過程中均發現培養基中有少量腦膜存在。NSCs的形態近似于圓形，直徑在5～10 μm，因此課題組先后采用200目和500目細胞篩（孔徑30 μm）過濾，過濾后的細胞懸液鏡下觀察未發現殘存的腦膜，而且可以將絕大部分腦組織分離成單細胞。此外，少量腦膜的存在對于NSCs成球率和未分化狀態的穩定性無影響。

3 培養基選擇的依據

血清含有豐富的營養物質，對促進細胞生長有積極作用。但有研究表明含血清培養基可以誘導NSCs分化，不利于維持NSCs處于未分化狀態[8]，因此課題組采用無血清培養基培養NSCs。大部分研究者采用由DMEM/F12（98%）+B27（2%）+bFGF（20 μg/L）+EGF（20 μg/L）配置而成的培養基。DMEM/F12培養基是NSCs體外培養常用的基礎培養基[9]。有研究指出B27能促進原代NSCs的增殖[10]。值得注意的是，Gibco公司生產的B27有多種類型，其中不含維生素A的B27不會誘導NSCs向神經元方向分化，有利于保持NSCs處于未分化狀態。bFGF可以促進NSCs的增殖[11]。EGF既可以促進NSCs的增殖，又可以促進其向神經元和神經膠質細胞分化。bFGF與EGF聯合應用可以促進NSCs體外增殖，抑制其分化[12]。本課題組采用由DMEM/F12（97%）+B27（2%）+青鏈霉素（1%）+bFGF（20 μg/L）+EGF（20 μg/L）配置而成的NSCs無血清培養基，培養出了狀態良好的神經球。需要注意的是，為保持bFGF和EGF的最大活性，每次應少量配制培養基。

4 接種密度的選擇

NSCs的生長密度對于其自身的增殖有重要的影響[13]。如果細胞密度過高，細胞則會聚集成團，導致營養供應不足，活性降低，甚至會出現大量死亡的狀況。如果細胞密度過低，細胞之間缺乏有效的連接，造成增殖速度減慢。因此掌握好NSCs的接種密度對于其生長十分關鍵。文獻中提及NSCs的接種密度從 1×105～1×107個/mL不等[14?16]。課題組按照1×105、1×106和1×107個/mL 3個密度進行接種，結果顯示1×106個/mL的NSCs成球速度快，神經球數量多且狀態良好。

5 不同培養方法對神經干細胞的影響

目前NSCs的培養方法主要有懸浮培養法和貼壁培養法。本課題組證實采用懸浮培養法可以形成穩定的神經球，有利于保持NSCs處于未分化的狀態，而采用貼壁培養法培養的細胞則非常容易分化。需要注意的是，在懸浮培養NSCs的過程中，拿、放培養瓶要盡量平穩，以免造成細胞球聚集形成較大的細胞團塊。

6 不同換液方式的體會

縱觀研究人員對NSCs的換液方法，有全量換液和半量換液，其中多數采用半量換液的方法。NSCs本身就是未充分發育的細胞，所以較其他細胞而言更加脆弱，對外界環境的變化更加敏感，因此維持NSCs生長環境的相對穩定十分重要，頻繁換液對細胞生長不利。NSCs生長不只是吸收培養基中的營養成分，還與NSCs自身分泌的活性物質（如生長因子、黏附分子和趨化因子等）有關，NSCs通過自分泌或旁分泌的方式調節自身的生物學特性，因此不推薦使用全量換液的方法。而只加液不棄液的方法較半量換液更方便，因此推薦使用每2～3 d只加液不棄液（25 cm2培養瓶每次添加培養基1～1.5 mL）的方法。

7 傳代經驗總結

7.1 傳代時機 懸浮培養的神經球狀態是判斷傳代時機的重要依據。據觀察，活力好的神經球通常透光均勻且邊緣明亮銳利。神經球的直徑不宜過大，直徑超過300 μm的神經球球心部較邊緣厚很多，透光性減弱，球心部顏色較邊緣暗。本課題組將NSCs培養至6～8 d，得到的神經球數量多、狀態良好，適宜傳代。

7.2 傳代方法 NSCs傳代方法主要有胰酶消化法、Accutase酶消化法[17]和機械吹打法等。酶消化法操作步驟：將含有NSCs的培養基轉移至離心管，靜置15 min，去上清，加入1 mL 0.125%的胰酶或1 mL Accutase酶，消化10 min，加入培養基終止消化，以1 500 r/min離心10 min，去上清，加入培養基，調整細胞密度為1×106個/mL，接種于培養瓶。機械吹打法操作步驟：將培養基轉移至離心管，靜置15 min，去上清，加入培養基，輕柔緩慢吹打10 min，調整細胞密度為1×106個/mL，接種于培養瓶。原代和1代的神經球細胞間連接不緊密，僅通過輕柔的吹打即可分離成單細胞懸液，且傳代后活細胞比例最高，成球率最高，神經球可以保持穩定的未分化狀態，吹打時要輕柔且避免產生氣泡。2代及以后神經球通過單純機械吹打無法使其完全分離為單細胞。采用胰酶消化法不容易掌握消化時間，對細胞損傷較大，活細胞比例相對較低，再次成球率低。損傷的細胞釋放其核內DNA，這些DNA具有很強的黏性，會將分離消化的單細胞黏附在一起。本課題組對原代和1代的神經球采用機械吹打法進行傳代，對2代及以后的神經球采用Accutase酶進行傳代。利用Accutase酶消化2代及以后的神經球對細胞損傷最小，活細胞比例較高，成球率較高，神經球狀態良好。

細胞培養過程中會出現死細胞、細胞碎片及細胞分解產物，如果不能及時清理這些物質則會影響NSCs的增殖。在傳代過程中，使神經球自然沉淀，然后去除上清液，這些物質可以被最大程度地去除。原代培養的NSCs中混有一些雜細胞，經過反復傳代培養后也可以被去除。

本課題組已經穩定傳代培養NSCs至第7代。馬浚寧等[18]發現從皮質提取的NSCs在傳至9～11代后會出現神經球貼壁的現象，海馬和嗅球區的NSCs也有類似現象，提示NSCs的懸浮特性會隨著傳代次數的增加而減弱。

8 神經干細胞標志物的選擇

目前已經發現的NSCs標志物有巢蛋白、Musashi、神經元特異性烯醇化酶、波形蛋白1、細胞黏附分子等。大部分研究者把巢蛋白作為鑒定NSCs的標志物，巢蛋白又稱為nestin，屬于Ⅵ型中間絲蛋白，其表達具有時序性，nestin在分裂增殖能力旺盛的NSCs中高表達，在NSCs向終末細胞（神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞）分化過程中逐漸減弱，已經廣泛應用于體外培養的NSCs的鑒定[19]。

9 總結

提取胎齡14 d胎鼠的大腦皮質，采用無血清培養基，以1×106個/mL的密度接種于25 cm2培養瓶（接種約3.5 mL），采取懸浮培養法，每2～3 d加液1～1.5 mL，每6～8 d傳代1次，所得到的NSCs增殖分裂旺盛、成球率高、神經球狀態良好，并且可以保持穩定的未分化狀態。該方法值得參考。