原發性肝細胞肝癌YAP、FOXP1 mRNA的表達及對患者預后的影響

陳 櫞，周 元，尹必輝，李懷亮，侯衛曉，周益龍，邵冰峰，張素青，徐愛兵，張一心*

1.南通大學附屬腫瘤醫院外科，南通 226300 2.南通大學醫學院研究生院臨床醫學系，南通 226019

肝癌在我國發病率居惡性腫瘤的第4位，死亡率居第3位[1]，其中原發性肝細胞肝癌(HCC)占85%～90%以上。南通地區位于江海平原，是乙型肝炎高發地區，大多數患者就診時病變已屬中晚期，如何早期監測肝癌的發生成為關鍵。目前認為，致癌基因的激活與腫瘤發生發展密切相關，抑制癌基因的高表達可以防止正常細胞向惡性轉化，甚至可使惡性腫瘤細胞向正常方向逆轉，從而達到治療腫瘤的目的[2]。Yes-associated protein(YAP)和Forkhead-box P1(FOXP1)是HCC的致癌基因，在HCC組織中二者是否相互作用，值得進一步研究。因此，本研究觀察HCC肝癌組織中YAP、FOXP1 mRNA的表達情況，初步探討二者對患者預后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2004年1月至2007年12月本院收治并經病理組織學確診的HCC患者的石蠟腫瘤標本共114例，其中男性91例，女性23例，中位年齡49.28歲(年齡范圍21～75歲)。腫瘤TNM分期按WHO診斷標準，收集患者臨床信息，包括年齡、性別、病理類型、臨床分期等。所有患者術前未經任何放化療和免疫治療，患者詳細資料見表1。本研究經醫院倫理委員會審核批準，所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑及儀器 Real-time RT-PCR試劑盒：High Pure RNA Tissue Kit、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、LightCycler480 SYBR Green Ⅰ Master均購自Roche公司。YAP、FOXP1、GAPDH引物由上海生工生物工程技術有限公司合成，具體序列如下，YAP引物序列：5′-CTA TTG GTC GTC ATT GTT CTC-3′(正向)，5′-AGT TAG CCC TGC GTA GCC-3′(反向)，FOXP1引物序列：5′-CGG TAC TCA GAC AAA TAC AA-3′(正向)，5′-GTC GGA AGT AAG CAA ACA-3′(反向)，GAPDH引物序列：5′-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3′(正向)，5′-AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3′(反向)。

1.3 Real time RT-PCR測定基因表達 HCC及癌旁石蠟組織(paraffin-embedded tissues)中RNA的提取：將蠟塊組織切成6～8 μm切片，至1.5 mL離心管中，加入1 mL二甲苯，混勻，離心2 min。取上清液，加入1 mL無水乙醇，混勻，離心2 min，取上清液。加入150 μL Buffer PKD，重懸沉淀。加入10 μL蛋白酶K，混勻。56℃孵育15 min，20 000×g離心15 min。取上清液，至1.5 mL離心管中。提取方法參照文獻[3-4]。Real time RT-PCR檢測方法參照Roche說明書，構建20 μL反轉錄反應體系，混勻后37℃溫浴5 min。42℃溫浴60 min，70℃溫浴10 min，終止反應。構建20 μL聚合酶鏈式反應PCR反應體系，擴增條件：94℃ 10 min；94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 20 s，共40個循環。

實時熒光定量PCR儀分析結果，根據陰性對照調整閾值和基線以確定各個標本的Ct值，并根據熔解曲線確定該Ct值是否有效。2-ΔΔCt值計算方法參照文獻[3]，進行相對表達量定量分析。參照文獻[5]，以癌旁組織作為對照組進行定性分析：若癌組織中表達量大于癌旁組織則為陽性，癌中表達量等于或小于癌旁組織則為陰性。

1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0進行數據分析，采用χ2檢驗分析YAP、FOXP1 mRNA表達水平與肝癌患者臨床特征的相關性，比較癌及癌旁組織中YAP、FOXP1的表達差異。采用T檢驗(Wilcoxon non-parametric signed-rank test)對組織中YAP、FOXP1 mRNA表達情況進行組內和組間差異分析，采用Pearson分析YAP、FOXP1 mRNA表達間的相關性。隨訪患者5年的無病生存期(disease-free survival, DFS)，單變量Cox比例風險回歸用于分析患者在各種不同影響因素下的生存差異，單變量回歸分析中的顯著因素進一步納入多因素回歸分析。檢驗水準(α)為0.05。

2 結 果

2.1 癌及癌旁組織YAP和FOXP1 mRNA的表達差異 Real time RT-PCR結果(圖1A)表明：HCC組織FOXP1 mRNA表達水平高于癌旁正常組織，差異有統計學意義(0.62±0.24vs0.28±0.17，P<0.000 1)，HCC組織YAP mRNA表達水平高于癌旁組織，差異有統計學意義(0.61±0.29vs0.20±0.12，P<0.000 1)。進一步相關性分析結果(圖1B)表明：HCC組織YAP、FOXP1 mRNA表達水平正相關(r=0.76，P<0.000 1)。

2.2 癌組織YAP、FOXP1 mRNA表達與患者臨床特征的相關性 結果(表1)表明：HCC組織YAP、FOXP1 mRNA陽性表達與患者腫瘤直徑、TNM分期、AFP相關(P<0.05)。

圖1 癌及癌旁組織YAP、FOXP1 mRNA的表達

表1 HCC組織YAP、FOXP1 mRNA表達與肝癌患者臨床特征的相關性

*P<0.05

2.3 HCC患者DFS影響因素分析 結果(表2)表明：隨訪5年，單因素回歸分析發現DFS生存時間受患者腫瘤分化程度、TNM分期、肝內腫瘤個數、AFP、HBV感染、YAP和FOXP1表達的影響(P<0.05)。

表2 患者隨訪5年DFS的單因素回歸分析

*P<0.05

2.4 Kaplan-Meier生存分析 結果(圖2)表明：YAP陽性HCC患者DFS生存時間短于YAP陰性患者(17個月vs26個月,P=0.020 7)；FOXP1陽性患者DFS生存時間短于FOXP1陰性患者(18個月vs27個月，P=0.004 2)；YAP、FOXP1共表達陽性患者DFS生存時間短于YAP、FOXP1共表達陰性患者(18個月vs24個月，P=0.003 7)，差異有統計學意義。結果提示：YAP、FOXP1陽性表達影響患者的治療效果，縮短了患者的DFS時間。

圖2 Kaplan-Meier生存分析HCC患者DFS

A:YAP表達陰性vsYAP表達陽性;B:FOXP1表達陰性vsFOXP1表達陽性;C:YAP、FOXP1共表達陰性vsYAP、FOXP1共表達陽性

3 討 論

HCC是目前我國較為常見的惡性腫瘤，且病死率居前3位。HCC治療方式首選手術治療，但術后5年腫瘤復發轉移率高達40%～70%，這與術前可能已存在微小播散灶或多中心發生有關，且合并有HBV感染及病毒復制活躍的HCC患者預后較無罹患肝炎的患者差[1]。南開大學的學者提出HBV相關蛋白X蛋白通過激活YAP/FOXA1信號通路影響HBV病毒復制，從而導致肝癌的發生[2]。其他研究人員研究了罹患HBV的HCC樣本后認為FOXP1可能參與HBV相關肝硬化的癌變過程[6]。而FOXP1是FOX家族轉錄因子成員之一，參與細胞增殖、分化和代謝過程。本課題組前期研究發現在HCC中FOXP1高表達影響HCC患者預后[5]，對HCC細胞增殖和遷移能力有影響[7]。利用轉染技術在細胞內抑制FOXP1表達，可抑制HCC細胞增殖，導致G1/S期受阻，有絲分裂時間延長，激活型Rb和磷酸化Rb的表達及E2F1表達在24 h時明顯降低[8]。

Hippo-YAP通路是控制腫瘤發生發展的一個重要的信號轉導通路。去磷酸化的YAP能結合轉錄因子，抑制凋亡和促進細胞增殖。Mizuno等[9]發現下調Hippo-YAP、FOXM1 mRNA的表達，可抑制惡性間皮瘤腫瘤細胞的生長和促進凋亡。YAP通過轉錄相關因子TEAD(transcription enhancer and activator domain)直接影響FOXM1的表達。Weiler等[10]對人肝癌細胞系、轉基因小鼠和肝癌組織進行分析，發現YAP與FOXM 1協同作用導致染色體不穩定。除肝癌外，Rizvi等[11]發現在膽管癌細胞中FOXM1的表達依賴于YAP，將沉默YAP基因導致FOXM1蛋白表達水平下降，能誘導膽管癌細胞的死亡。此外，還有研究發現FOXM1和YAP在卵巢癌中的表達也有相關性[12]。YAP不僅與FOXM1有關，還與FOX家族的其他成員有關。有研究[13]表明在肝癌細胞中RANT相關轉錄因子2與YAP之間密切相關，其相互作用是通過依賴FOXA1調控的抑制腫瘤抑制因子lncRNA，從而達到致癌作用。Hippo通路通過抑制YAP-FOXO1的功能而對心肌細胞的存活產生抑制作用[14]。同樣，YAP不僅在HCC中高表達，也在膽管癌中高表達，敲除SGC-7901和MGC-803胃癌細胞中FOXA1發現YAP的表達量下降，抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡[15]。

不僅在腫瘤中YAP與FOX家族基因關系密切，在體細胞中二者間也有相關性。Yuan等[16]體外研究胰島素β細胞發現YAP的過度表達能顯著誘導人胰島β細胞增殖，且能誘導胰島素分泌β細胞中的抗凋亡作用所需要的Trx 1/2生成，具有較強的促增殖和抗凋亡功能，且發現FOXM 1在YAP過表達時被上調，是YAP依賴的β細胞增殖所必需的。YAP過表達可保護β細胞免受多種導致糖尿病條件所誘導的凋亡，可用于恢復糖尿病患者的外分泌功能。在心肌細胞中下調miR-206的表達水平抑制誘導心肌肥大和存活的YAP的表達水平，同時FOXP1過表達又影響miR-206的表達[17]。由此可見，在心肌細胞中FOXP1和YAP間通過miR-206相互作用。Hippo-YAP-FOXA2信號通路在肺外周成熟和表面活性物質穩態中也起著重要作用[18]。

RT-PCR技術已經被廣泛應用于臨床檢測多種惡性腫瘤石蠟樣本中相關基因的表達水平，包括肺癌[19]、浸潤性膀胱癌[20]、胃癌[21]、肝癌[22]等惡性腫瘤。國外研究[3-4]表明從石蠟組織中提取mRNA與冰凍組織中提取mRNA幾乎一致，且與免疫組化(IHC)測定結果約90%的一致性。本課題組前期研究了FOX家族的FOXP1[6]在肝癌組織中表達情況，采用RT-PCR和免疫組化技術證實了FOXP1在癌組織中的高表達，且癌組織高于癌旁組織，其高表達影響HCC預后，在此基礎上，進一步分析FOXP1與Hippo-YAP信號通路之間的關系。本研究在之前研究的基礎上，回顧性分析FOXP1與YAP表達水平相關性，發現癌組織YAP和FOXP1 mRNA表達均大于癌旁組織，YAP與FOXP1的mRNA與腫瘤直徑、TNM分期、AFP水平有關，且二者表達正相關。單因素分析結果發現患者的DFS與患者腫瘤的分化程度、TNM分期、肝內腫瘤個數、AFP水平、HBV感染、YAP、FOXP1高表達有關；進一步多因素分析發現患者肝癌術后復發與患者HBV感染和YAP、FOXP1高表達有關，YAP、FOXP1共同影響HCC患者術后復發。

隨著我國經濟及醫學的發展，多種抗癌靶向藥物不再是遙不可及，給術后復發患者的治療帶來了多種選擇的機會，有望延長肝癌患者總生存率(overall survival, OS)。越來越多的癌基因及抑癌基因的發現表明癌癥相關基因不再是孤立的影響因素，而是在相互作用下共同發揮作用，給臨床研究帶來了新的挑戰。