Myc/his-TDP-43融合蛋白對tau外顯子10可變剪接的影響

繆世琛，屈舒婷，陸 穎，唐 嘯，任梁梁，顧建蘭

南通大學醫學院，南通 226001

反式激活反應DNA結合蛋白(trans-active response DNA-binding protein of 43 kDa, TDP-43)包含414個氨基酸，存在于各種神經退行性疾病中，包括路易體病、皮質基底節變性和阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)等[1-2]。TDP-43含有2個高度保守的RNA識別基序(RNA recognition motif，RRM)和1個富含甘氨酸的尾巴[3]。其中，RRM的主要功能是介導TDP-43與雙/單鏈DNA、RNA結合，是TDP-43發揮可變剪接調節作用所必需的。

Tau蛋白過度磷酸化是AD的致病機制之一。為了探討TDP-43對tau基因剪接以及表達的調節，本課題組構建了pCI/TDP-43·HA，發現其在細胞中過表達后可促進4R-tau的表達[4]。TDP-43是高度磷酸化的磷蛋白，其功能受磷酸化調控。本課題組后續須研究哪些蛋白激酶可以磷酸化TDP-43和可能的磷酸化位點，及磷酸化后對TDP-43調節tau功能的影響。本課題組現有的蛋白激酶，如酪蛋白激酶[5]、蛋白激酶A[6]等表達質粒都構建在與TDP-43相同的載體pCI-Neo質粒上，且攜帶相同的HA標簽。這為利用表達標簽的優勢研究蛋白激酶和TDP-43的相互作用帶來了困難。因此，本研究將TDP-43構建到帶myc、his標簽的pcDNA3.1載體上，將pcDNA3.1/TDP-43·myc·his和tau迷你基因共轉染，探討myc/his標簽肽對TDP-43蛋白在tau外顯子10可變剪接中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 細菌、細胞和質粒：大腸桿菌DH5α購自天根生化科技(北京)有限公司；pCAG/TDP-43質粒購自Origene公司；HEK-293FT細胞(人胚腎細胞)和N2a細胞(小鼠神經瘤母細胞)購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所。抗體和其他試劑：myc抗體(9E10)購自Millipore公司；tubulin抗體購自Sigma公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠、羊抗兔IgG抗體購自Jackson Immuno Research Laboratories公司；抗GAPDH抗體購自Santa Cruz公司。BamH Ⅰ、NotⅠ購自NEB公司；DNA marker、T4DNA連接酶購自Promega公司；……