Myc/his-TDP-43融合蛋白對tau外顯子10可變剪接的影響

繆世琛，屈舒婷，陸 穎，唐 嘯，任梁梁，顧建蘭

南通大學醫學院，南通 226001

反式激活反應DNA結合蛋白(trans-active response DNA-binding protein of 43 kDa, TDP-43)包含414個氨基酸，存在于各種神經退行性疾病中，包括路易體病、皮質基底節變性和阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)等[1-2]。TDP-43含有2個高度保守的RNA識別基序(RNA recognition motif，RRM)和1個富含甘氨酸的尾巴[3]。其中，RRM的主要功能是介導TDP-43與雙/單鏈DNA、RNA結合，是TDP-43發揮可變剪接調節作用所必需的。

Tau蛋白過度磷酸化是AD的致病機制之一。為了探討TDP-43對tau基因剪接以及表達的調節，本課題組構建了pCI/TDP-43·HA，發現其在細胞中過表達后可促進4R-tau的表達[4]。TDP-43是高度磷酸化的磷蛋白，其功能受磷酸化調控。本課題組后續須研究哪些蛋白激酶可以磷酸化TDP-43和可能的磷酸化位點，及磷酸化后對TDP-43調節tau功能的影響。本課題組現有的蛋白激酶，如酪蛋白激酶[5]、蛋白激酶A[6]等表達質粒都構建在與TDP-43相同的載體pCI-Neo質粒上，且攜帶相同的HA標簽。這為利用表達標簽的優勢研究蛋白激酶和TDP-43的相互作用帶來了困難。因此，本研究將TDP-43構建到帶myc、his標簽的pcDNA3.1載體上，將pcDNA3.1/TDP-43·myc·his和tau迷你基因共轉染，探討myc/his標簽肽對TDP-43蛋白在tau外顯子10可變剪接中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 細菌、細胞和質粒：大腸桿菌DH5α購自天根生化科技(北京)有限公司；pCAG/TDP-43質粒購自Origene公司；HEK-293FT細胞(人胚腎細胞)和N2a細胞(小鼠神經瘤母細胞)購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所。抗體和其他試劑：myc抗體(9E10)購自Millipore公司；tubulin抗體購自Sigma公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠、羊抗兔IgG抗體購自Jackson Immuno Research Laboratories公司；抗GAPDH抗體購自Santa Cruz公司。BamH Ⅰ、NotⅠ購自NEB公司；DNA marker、T4DNA連接酶購自Promega公司；PrimeSTARTMHS DNA聚合酶購自TaKaRa公司；質粒小量抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；預染蛋白Marker購自Bio-Rad公司；RT試劑盒、DMEM培養基、胎牛血清購自Invitrogen公司；蛋白定量試劑盒和ECL化學發光試劑盒購自Pierce公司；Fugene HD購自Roche公司。引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。培養板及相關細胞實驗耗材購自Corning公司。

1.2 真核表達質粒pcDNA3.1/TDP-43·myc·his的構建 根據GenBank報道的TDP-43編碼序列(coding sequence)，設計并合成了相應的上下游引物，以pCAG/TDP-43為模板，擴增目的基因，反應總體系100 μL，含5×反應緩沖液20 μL，模板pCAG/TDP-43共20 ng，上、下游引物各2 μL(10 μmol/L)，PrimeSTARTMHS DNA聚合酶1 μL(2.5 U/μL)，dNTP mix 8 μL(10 mmol/L)；擴增條件為98℃ 預變性5 min，98℃ 30 s、68℃ 90 s重復35個循環，總延伸為68℃ 10 min。

瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用DNA回收試劑盒回收PCR產物。純化的PCR產物和pcDNA3.1的空載質粒分別用限制性核酸內切酶BamH Ⅰ和NotⅠ進行雙酶切，37℃過夜。酶切后電泳鑒定并用凝膠回收試劑盒回收酶切產物。將酶切回收后的pcDNA3.1空載和TDP-43目的片段按1∶8的比例，用T4DNA連接酶(10 μL體系)4℃連接過夜。

全部連接產物轉化到DH5α感受態細胞，涂布于含100 μg/mL的氨芐青霉素(ampicillin, Amp)的瓊脂糖平板上，37℃孵箱內倒置培養過夜。挑取3～4個單菌落，接種于含Amp的5 mL LB液體培養基中，37℃培養過夜。離心后回收菌體，用質粒小量抽提試劑盒抽提質粒。質粒用BamH Ⅰ和NotⅠ雙酶切3 h后電泳，選取在1 200 bp處有目的條帶的克隆進行測序鑒定。將經PubMed比對正確的質粒用于后續實驗。

1.3 細胞培養和轉染 HEK-293FT細胞用含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的Dulbecco’s modified eagle medium(DMEM)培養基，N2a細胞用含10%血清的DMEM/F12培養基于37℃、5% CO2培養箱中培養，倒置相差顯微鏡下觀察細胞。轉染前1 d，細胞用0.25%的胰蛋白酶消化，用不含抗生素的DMEM/FBS培養基終止反應，細胞以50%的融合度接種于24孔細胞培養板中，每組3個復孔。第2天，細胞覆蓋達90%左右，按照Fugene HD操作說明進行轉染，48 h后處理細胞。

1.4 Western印跡法測定蛋白表達 細胞轉染48 h后，每孔細胞用100 μL 1×Loading buffer 于100℃ 沸水中裂解5 min。提取的蛋白用Pierce OD660蛋白定量試劑盒測定濃度后，調整蛋白濃度一致，10%或12%SDS-PAGE電泳分離后，電轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，anti-myc單克隆抗體(1∶1 000)或anti-tubulin(1∶5 000)、anti-GAPDH抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜，用含0.1% Tween 20的TBS(TBST)洗滌后，與辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標記的二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次后顯影。

1.5 反轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) Tau迷你基因和不同量的TDP-43或siTDP-43轉染至HEK-293FT細胞，48 h后用RNA抽提試劑盒(OMEGA)提取總RNA，取總RNA 1 μg，加入5 mmol/L dNTP mix 2 μL、10 μmol/L Oligo dT181 μL、補適量DEPC水至總體積10 μL，65℃ 5 min；加入10×反轉錄buffer 2 μL、MgCl24 μL、DTT 2 μL、40 U/μL RNase OUTTM1 μL、200 U/μL SuperScrip Ⅲ 1 μL，50℃ 50 min、85℃ 5 min；加入RNaseH 1 μL (2 U)，37℃ 20 min。以cDNA為模板，用PrimeSTARTMHS DNA Polymerase(TaKaRa)進行PCR反應檢測tau外顯子10的可變剪接，引物序列為：5′-GGT GTC CAC TCC CAG TTC AA-3′(上游)，5′-CCC TGG TTT ATG ATG GAT GTT GCC TAA TGA G-3′(下游)。鼠GAPDH引物序列：5′-TGC TGA GTA TGT CGT GGA GTC TA-3′(上游)，5′-AGT GGG AGT TGC TGT TGA AGT CG-3′(下游)。擴增條件為98℃預變性5 min，98℃ 10 s、68℃ 40 s 共30個循環，總延伸為68℃ 10 min。PCR產物經1.5%的瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL溴化乙錠)電泳后，分析條帶。

1.6 TDP-43各截斷體的構建 根據TDP-43蛋白的結構設計并合成各截斷體的引物，以構建成功的pcDNA3.1/TDP-43·myc·his為模板擴增目的基因。純化的PCR產物和pcDNA3.1空載體分別用BamH Ⅰ和NotⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，回收酶切產物。將酶切后的pcDNA3.1和TDP-43各截斷體的片段在4℃連接、轉化，通過Amp選擇培養后，挑斑搖菌，提取質粒，酶切鑒定后測序。

2 結 果

2.1 pcDNA3.1/TDP-43·myc·his全長質粒的構建 結果(圖1)顯示：電泳圖1.2 kb處有目的片段，測序結果也顯示pcDNA3.1/TDP-43·myc·his質粒構建成功。

圖1 pcDNA3.1/TDP-43·myc·his全長質粒的酶切鑒定

2.2 過表達或下調TDP-43對tau迷你基因可變剪接的影響 為驗證pcDNA3.1/TDP-43對tau外顯子10可變剪接的影響，在HEK-293FT細胞中過表達不同量的pcDNA3.1/TDP-43·myc·his，同時共轉tau迷你基因SI9/SI10。48 h后，RT-PCR檢測tau外顯子10的可變剪接產物；Western印跡法檢測TDP-43(anti-myc)的表達。結果顯示：TDP-43促進tau外顯子10的編碼，促進作用呈劑量依賴性(圖2A)。進一步的驗證實驗結果顯示：TDP-43促進tau外顯子10的表達，siTDP-43下調TDP-43表達后則作用相反(P<0.05或0.01，圖2B)。

圖2 過表達或下調TDP-43對tau迷你基因SI9/SI10可變剪接的影響

2.3 TDP-43及其各截斷體質粒的構建和表達 pcDNA3.1/TDP-43·myc·his全長質粒為模板，PCR擴增獲取目的片段，雙酶切(圖3A)鑒定及公司測序鑒定結果顯示，TDP-43系列截斷體構建成功。將pcDNA3.1/TDP-43·myc·his及各截斷體質粒轉染至HEK-293FT細胞，48 h后Western 印跡結果(圖3B)顯示，除缺失核定位信號的4個質粒(pcDNA/TDP-43-188-414、237-414、255-414、273-414)外，其余質粒均在相應的相對分子質量附近有蛋白表達。

圖3 pcDNA/TDP-43各截斷體的酶切鑒定和表達

A：TDP-43各截斷體用BamH Ⅰ和NotⅠ于37℃酶切3 h后電泳結果；B：HEK-293FT細胞中轉染TDP-43及各截斷體質粒48 h后Western 印跡結果.1: TDP-431-104; 2: TDP-431-179; 3: TDP-431-275; 4: TDP-431-306; 5: TDP-431-383; 6: TDP-43100-275; 7: TDP-43100-414; 8: TDP-43188-414; 9: TDP-43237-414; 10: TDP-43255-414; 11: TDP-43273-414; 12: TDP-43

3 討 論

AD是老年人常見的神經變性疾病。AD的病因及發病機制尚未明確，特征性病理改變為β-淀粉樣蛋白沉積形成的細胞外老年斑和異常過度磷酸化的tau蛋白聚集形成的神經細胞內神經元纖維纏結[7]。Josephs等[8]研究發現，57%AD患者的神經元內含有TDP-43，提出TDP-43可能是與AD發病相關的第3種蛋白質。

TDP-43是一種DNA和RNA結合蛋白，參與mRNA的穩定、RNA轉錄、剪接、RNA加工、microRNA的生物合成、細胞凋亡、細胞分裂、神經元完整性和可塑性等的調節[3]。TDP-43異常聚集與肌肉萎縮性側索硬化癥(漸凍癥)有關，并在AD的進展中扮演著重要角色[5]。TDP-43在AD病理進程中的作用機制目前尚不清楚。高度保守的SR核蛋白家族參與體外前體mRNA剪接位點的選擇，其中SC35、9G8、ASF/SF2等參與tau外顯子10可變剪接的調節[9-11]。本課題組最近研究[4]結果發現，pCI/TDP-43·HA可以促進4R-tau的表達。本研究成功構建了pcDNA3.1/TDP-43·myc·his質粒，與tau迷你基因SI9/SI10共轉后，發現TDP-43呈劑量依賴性地促進4R-tau的表達，下調TDP-43則抑制4R-tau的表達。該結果證明，攜帶不同的標簽肽不影響TDP-43對tau外顯子10可變剪接的促進作用。

TDP-43蛋白全長分子中含有多個絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸位點，其中有多個潛在的磷酸化位點(NetPhos 2.0軟件分析結果)。文獻[12-13]報道，酪蛋白激酶可磷酸化TDP-43，促進TDP-43在細胞內的聚集。為進一步研究蛋白激酶對TDP-43的磷酸化及磷酸化對TDP-43功能的影響，后續實驗將把構建在pcDNA3.1載體上、帶myc/his標簽的TDP-43全長或各截斷體質粒和構建在pCI-Neo載體上、帶HA標簽的酪蛋白激酶、蛋白激酶A等蛋白激酶質粒共轉入細胞表達，觀察哪些蛋白激酶可以磷酸化TDP-43及各結構域在AD等神經退行性病變中作用的分子機制，以期為神經退行性疾病的防治提供分子生物學依據。