環狀RNA與腫瘤研究進展

宋東強，史冬敏，張順財

1.復旦大學附屬中山醫院肝癌研究所，上海 200032 2.復旦大學附屬中山醫院消化科，上海 200032

近期，Science、MolecularCell雜志分別報道了環狀RNA(circular RNA, circRNA)的最新研究成果[1-2]，使circRNA重新受到廣泛關注。circRNA是一類普遍存在于真核細胞基因組中，具有基因調控作用的內源性RNA。20世紀70年代，circRNA首次在病毒中被發現[3]，隨后在酵母線粒體中被找到[4]。在過去近30年內，circRNA被證實存在于病毒、古生菌、植物和人體細胞等多種生物體內[5-9]。但其一直被認為是在轉錄過程中錯誤剪接而形成的副產物，無重要生物學功能。

近年來，隨著生物物理學、RNA測序技術和生物信息學等技術的快速發展，高通量、長讀段為特征的大量轉錄組數據被發現，生物體中越來越多的 circRNA隨之被發現。Memczak等[10]通過RNA-seq數據結合人白細胞數據庫，在人類、小鼠及線蟲中分別鑒定出1 950種、1 903種和724種circRNA(其中小鼠與人類有81種circRNA相同)，并成立了1個circRNA數據庫(http://www.circbase.org/)，可在線查詢。Liu等[11]通過檢測464例人RNA-seq樣本的全轉錄組，鑒定了circRNA的表達譜(包含已知和新發現的circRNA)，并在此基礎上建立了目前第1個提供組織特異性的circRNA表達譜以及circRNA-miRNA基因調節通路的公共數據庫，即CircNet Database (http://circnet.mbc.nctu.edu.tw/)。上述研究使人們認識到基因外顯子可3′端和5′端共價連接形成環狀結構的circRNA在真核細胞內表達豐富且穩定，這種結構能抗RNA外切酶降解。

1 circRNA的形成

關于circRNA的形成機制尚無定論，目前主要有2種機制。(1)在轉錄過程中，前體mRNA(pre-mRNA)中的外顯子轉錄本被非線性地反向剪接形成circRNA，分為套索驅動的環化和內含子配對驅動的環化(圖1A,1B)。這種circRNA被稱為外顯子來源的circRNA[12-13]。(2)另外一種理論認為內含子也可以形成circRNA。Zhang等[14]提出了內含子自身環化(圖1C)，這類由內含子自身環化形成的circRNA被稱為內含子circRNA。

圖1 環狀RNA形成示意圖

A：內含子配對驅動的環化[15]；B：套索驅動的環化[15]；C：內含子自身環化[14]

2 circRNA的特征

circRNA的主要特征包括：(1)circRNA廣泛存在于多種真核生物中，包括人類[16-18]；(2)主要位于細胞質，少數位于細胞核[14]，非常穩定，不易被核酸外切酶RNaseR降解[10,16,19]；(3)大部分circRNA具有高度保守序列[16,18]；(4)circRNA主要來源于外顯子，內含子來源circRNA及由外顯子和內含子共同組成的 circRNA則較少[10,16,19-20]；(5)有些circRNA具有微小RNA(microRNA，miRNA)結合位點，能與miRNA相互結合，從而調控靶基因的表達[6,16]；(6)大部分通常不編碼蛋白，屬于非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)[16]；(7)主要在轉錄及轉錄后水平發揮調控作用[14,19]；(8)少量circRNA可以翻譯成蛋白質[21]。

3 circRNA與腫瘤的相關性

circRNA的miRNA海綿作用使其能通過競爭性吸附內源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)調控基因表達[10, 22]，具體表現為circRNA通過結合miRNA來阻斷其對特異靶mRNA的抑制作用，從而調控miRNA靶基因的表達水平[23]。此外，circRNA還能夠作為轉錄后調控因子，調控RNA表達[23]、蛋白質活性[10, 22]等功能。

3.1 ciRS-7/CDRlas作用機制 circRNA可以通過多個途徑影響腫瘤的進程。ciRS-7/CDRlas是目前研究較多的一種circRNA，其miR-7結合位點超過70個；ciRS-7/CDRlas通過結合miR-7抑制miR-7的活性[10]，進而調控miR-7靶基因的表達[22]。而miR-7涉及多種生物學通路，可直接作用于腫瘤發生的相關靶基因，調控腫瘤因子的表達。

大量研究[24]表明，miR-7對腫瘤具有明顯的抑制作用。在腫瘤增殖及轉移研究中，miR-7通過靶向作用于黏著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)的3′非編碼區，負向調節其表達水平，阻斷乳腺癌細胞的上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)過程，進而抑制了癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[24]。PAX6是表達于結直腸癌細胞的高度保守的轉錄因子，其通過激活ERK/PI3K信號通路，上調基質金屬蛋白酶2(MMP2)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)的表達水平，促進結直腸癌的進展；PAX6也是miR-7的直接靶標，兩者表達負相關，miR-7能下調PAX6的表達，抑制結直腸癌的生長、增殖、轉移[25]。Fang等[26]發現，miR-7可以靶向作用于蘇氨酸激酶(Akt)，負性調節PI3K/Akt信號通路，從而將肝癌細胞周期阻斷在G0/G1期。在舌鱗癌中，miR-7促使胰島素生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R) 下調，從而削弱IGF1誘導Akt活化的能力，進而阻斷細胞周期，抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡[27]。在乳腺癌MDA-MB-468、肺癌A549細胞及膠質母細胞瘤DU145中，miR-7能顯著降低表皮生長因子受體( epidermal growth factor receptor protein，EGFR)的表達水平，從而抑制腫瘤細胞周期,基因芯片進一步發現，癌基因Raf1、蛋白激酶B(PKB)及細胞外信號調節激酶 1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)的下降[28]。但是，miR-7也有促癌作用。如病毒致癌基因E6/E7在HPV陽性的HeLa細胞系中的表達水平與miR-7正相關[29]。Nakagawa等[30]發現，miR-7在人結直腸癌組織中的表達水平顯著高于正常黏膜。因此，ciRS-7/CDRlas通過調控miR-7水平而調節腫瘤增殖及轉移等。

3.2 消化道惡性腫瘤 Bachmayr-Heyda等[31]通過對31對人結腸癌組織和相應的癌旁組織進行RNA測序，發現circRNA的豐度顯著低于對應的正常結腸組織。Li等[32]通過檢測101對胃癌及癌旁組織標本中hsa_cir_002059的表達水平及其與臨床病理學特征的相關性，發現該circRNA在胃癌組織中表達下調，且與TNM分期以及遠處轉移相關，提示hsa_cir_002059可作為胃癌診斷的一個潛在分子標志物。另外，Li等[33]分別對358、326對人食管癌和對應的癌旁組織進行qRT-PCR檢測，結果發現，cir-ITCH在食管癌的表達水平顯著低于癌旁組織，且差異有統計學意義。cir-ITCH通過海綿吸附miR-216b、miR-17、miR-214、miR-7和miR-128，間接提高miRNA靶基因ITCH的表達水平，而高表達的ITCH能夠促進磷酸化Dvl2的泛素化和降解，通過調節Wnt/β-catenin信號通路抑制腫瘤細胞的增殖[33]。

3.3 肝細胞肝癌 Qin等[34]發現，hsa_circ_0001649在肝癌細胞中明顯下調，其表達與腫瘤大小明顯負相關(P=0.045)，同時發現hsa_circ_0001649的表達與癌栓形成相關。在細胞實驗中，用siRNA下調肝癌細胞系HCC-LM3和MHCC-97L中的hsa_circ_0001649，MMP9、 MMP10和MMP13的mRNA表達水平顯著上升，表明hsa_circ_0001649可能與肝癌轉移密切有關。Huang等[35]應用基因芯片技術分別檢測了肝癌及癌旁組織circRNA的表達差異，發現與癌旁組織相比，肝癌組織中有226個circRNA的表達有明顯差異，其中189個上調、37個下調；通過qRT-PCR進一步驗證發現，hsa_circRNA_104075和 hsa_circRNA_100338明顯上調。Huang等[35]進一步在臨床上選擇了80例乙肝相關的肝細胞肝癌患者的肝癌組織樣本，選擇表達明顯升高的hsa_circRNA_100338作為檢測目的基因，發現癌組織及癌旁組織均有circRNA_100338表達，且circRNA_100338低表達組的累計生存率(72%)明顯高于高表達組(42.9%)；circRNA_100338表達與TNM分期、血管侵襲和肺轉移明顯相關，circRNA_100338可以作為乙肝相關肝癌預后評價的生物標志物。

circRNA還有可能通過調控肝癌細胞細胞周期促進腫瘤進展。Ren等[36]應用Arraystar Human circRNA Array 和Arraystar Human mRNA Array芯片分析肝癌組織的circRNA和mRNA，發現127個circRNA(113上調、14下調)和3 235個mRNA(1 923個上調、1 312個下調)的表達有顯著差異。通過KEGG Pathway分析和GO 分析3 235個mRNA發現，表達上調的mRNA主要參與細胞周期及細胞分裂，而下調基因與各種代謝過程有關。該研究選擇了5個上調最顯著的circRNA作為研究對象，通過miRNA數據庫預測circRNA與miRNA 的相互作用，構建circRNA-miRNA-mRNA網絡。GO富集分析發現，這些mRNA參與腫瘤相關信號通路，如p53信號通路、血管生成和細胞周期信號通路。為了驗證預測結果的準確性，Ren等[36]進一步在40例肝癌組織樣本中，應用qRT-PCR分析這5 個circRNA的表達水平，發現與癌旁組織相比，肝癌組織中circZFR、circFUT8和circPO11表達水平顯著升高，與芯片分析結果一致，說明circZFR、circFUT8和circPO11可作為腫瘤診斷及治療新的生物標志物。

3.4 其他腫瘤 類似的生物信息學技術同樣在其他腫瘤[37-39]中得到廣泛應用。越來越多的腫瘤，如肺癌[40]、口腔鱗癌[41]中發現了circRNA的表達，且參與多種信號通路的調控，為腫瘤的早期診斷及治療提供新的依據及治療靶點。

4 問題與展望

腫瘤是嚴重威脅人類生命健康的惡性疾病。由于癌癥的復雜性，人們對癌癥發生和發展機制的認識還不能滿足對其防、診、治的需求。因此，深入解析癌癥發生發展的分子機制和調控規律，進而研發癌癥的早期檢測、分子分型和預后預測方法及新型治療藥物等，是生物醫學研究的重要任務。隨著新一代RNA測序技術和生物信息學技術的發展，circRNA在越來越多的腫瘤中被發現，且對各種腫瘤中circRNA的結構、功能有了更深入的理解。circRNA表達穩定、半衰期長，同時在不同腫瘤中特異表達等特點，使其可能成為新的腫瘤標志物應用于腫瘤的早期診斷和篩查。同時，circRNA表達與腫瘤生物學特性密切相關，使其可能成為腫瘤個體化治療及靶向治療等新藥研發的新靶點,將來可以通過人工合成circRNA的方式將其應用于腫瘤的靶向治療。但circRNA仍有很多未知功能有待進一步研究，其臨床適用性也需要進一步探索。