不同方法炮制人中黃與甘草鎮痛抗炎鎮咳藥理作用的比較研究※

夏云嶺 王勝超 張 悅 陳祎甜 張江山 張振凌*

（1 河南中醫藥大學藥學院中藥炮制學科，河南 鄭州 450046；2 呼吸疾病診療與新藥研發河南省協同創新中心，河南 鄭州 450046）

甘草，豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根莖。具有補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調和諸藥的功效[1]?，F代藥理學研究表明，甘草具有保肝、抗菌、抗病毒、鎮咳、抗瘧等多種活性[2]，并具有抗炎鎮痛的藥理作用[3]，人中黃，是將甘草末置于竹筒中，搗實封口，浸漬于人糞坑中一段時間后的制成品，其性寒涼，味甘、咸，歸心、胃經，主要具有瀉火解毒，清熱涼血的功效，多用于治療天行熱、瘟毒、疫戾、痰火、痘疹等疾病[4]，現載于《中華本草》哺乳類。但是由于傳統制作過程和生產環境不衛生，造成該種炮制品瀕于失傳。本實驗室前期總結人中黃由來及炮制方法歷史沿革[5]，考析其藥性功效[6]，探究炮制機理，對其炮制前后的化學成分變化進行了分析對比研究，發現甘草素、異甘草素、甘草查爾酮A、甘草次酸為升高類成分，甘草酸和甘草苷為降低類成分[7]，并在此基礎上，設計新的炮制方法，制備成為新的人中黃炮制品[8]。本實驗首次以甘草為陽性對照，比較人中黃的鎮痛、抗炎、鎮咳藥理作用，并對新法與傳統方法炮制品進行了對比，為傳統炮制人中黃的作用機理和進一步研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 器材 YP10002型電子天平 (上海衡際科學儀器有限公司)，TGL-16gR型高速冷凍離心機 (上海安亭科學儀器廠)，BS210S型1/1萬電子天平 (北京賽多利斯天平有限公司)，YSL-8A型多功能誘咳引喘儀（濟南益延科技發展有限公司），8 mm打孔器。

1.1.2 藥品與試劑 甘草飲片為安徽亳州市售藥材，經河南中醫藥大學董誠明教授鑒定為豆科植物甘草Glycyrrhizae uraleusis Fisch.的干燥根及根莖；人中黃樣品由本實驗室按照人中黃制備方法制備。二甲苯 (分析純），天津市福晨化學試劑廠，批號20060823；冰醋酸 (分析純)，天津市富宇精細化工有限公司，批號20170826。

1.1.3 動物 清潔級昆明小鼠，體質量 (20±2)g，由山東省實驗動物中心提供，許可證號SCXK(魯)20140007，清潔級動物飼養室飼養。動物實驗均符合河南中醫藥大學動物倫理審查指南的相關規定。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

1.2.1.1 傳統法人中黃樣品制備 取直徑約10 cm的新鮮竹子，刮去青皮，制成一端封口的竹筒，將甘草粉末 (3號篩)搗實于竹筒內，膠塞封口，熬蠟密封晾干。選無農藥的糞池，將密封好的竹筒沉于池底，約60 d取出，清水沖洗至無異味，開竹取出，日夜曝曬約7 d即可。

1.2.1.2 新法人中黃樣品制備 取直徑約10 cm的新鮮竹子，刮去青皮，制成一端封口的竹筒，將甘草粉末 (3號篩)夯實于竹筒內，膠塞封口，熬蠟密封晾干。將竹筒浸泡于一定濃度氨水桶中，約60 d取出，清水沖洗至無異味，開竹取出，日夜曝曬約7 d即可。

1.2.1.3 水煎液制備 取人中黃粉末，裝入茶包中，加20倍量水浸泡0.5 h，煎煮2次，每次0.5 h，過濾，合并煎液，濃縮至0.13 g·mL-1，自制人中黃高、中、低劑量組依次濃縮為0.26，0.13，0.65 g·mL-1。

1.2.2 醋酸扭體實驗 取雄性小鼠，隨機分為6組，分別為空白對照組、甘草（陽性組）、傳統法炮制人中黃組、新法炮制人中黃高、中、低劑量組，每組10只，空白對照組給予等體積生理鹽水。連續灌胃給藥7 d，末次給藥1.5 h后，各鼠腹腔注射0.6%冰醋酸溶液0.2 mL，觀察15 min內小鼠的扭體反應（小鼠腹部內凹，后肢與軀干伸張，同時臀部抬起）次數，并計算各組扭體反應鎮痛率。鎮痛率=（空白對照組平均扭體次數－給藥組平均扭體次數）/空白對照組平均扭體次數×100%[9-10]。

1.2.3 二甲苯致小鼠耳腫脹實驗 取雄性小鼠60只，分組同1.2.2。連續灌胃給藥9 d，于末次給藥后1.5 h后，用二甲苯0.04 mL/只均勻涂抹于右耳兩面致炎，左耳作為對照。致炎后1 h脫頸椎處死小鼠，以8 mm直徑打孔器取下耳緣左、右耳片，稱重，以右、左耳片重量差表示腫脹度，并計算腫脹抑制率。腫脹抑制率=（空白對照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度）/空白對照組平均腫脹度×100%。

1.2.4 氨水致小鼠咳嗽實驗 取小鼠60只，雌雄各半，分組同1.2.2。連續灌胃給藥7 d，末次給藥后1.5 h，將小鼠放入誘咳引喘儀中，濃氨水噴霧15 s，觀察和記錄小鼠咳嗽潛伏期（開始噴霧氨水至發生咳嗽的時間）和2 min內咳嗽次數（以腹部收縮、口部張開為指標，記1次咳嗽），計算咳嗽抑制率?？人砸种坡?（空白對照組平均咳嗽次數－給藥組平均咳嗽次數）/空白對照組平均咳嗽次數×100%。

2 結果

2.1 對醋酸致小鼠扭體的影響 與空白對照組比較，傳統法炮制人中黃組（P<0.01）及新法炮制人中黃中劑量組（P<0.001）可顯著減少小鼠扭體次數，抑制醋酸致小鼠疼痛反應，疼痛抑制率與新法炮制人中黃劑量呈現正相關。與甘草組比較，傳統法炮制人中黃組（P<0.01）及新法炮制人中黃中劑量組（P<0.001）扭體次數明顯減少。與傳統法炮制人中黃組相比，新法炮制人中黃中劑量組對醋酸致小鼠扭體的抑制作用無顯著差異 （P>0.05）。

表1 對醋酸致小鼠扭體的影響 （）

表1 對醋酸致小鼠扭體的影響 （）

注：與空白對照組比較，1)P＜0.01，2)P＜0.001；與甘草組比較，3)P＜0.05，4)P＜0.01，5)P＜0.001；與傳統法炮制人中黃組比較，6)P＜0.05，7)P＜0.01

61.0±10.08 57.2±14.057)42.9±14.661,4)31.1±8.502,5,6)34.3±7.472,5)45.6±10.071,3)組別 只數 疼痛抑制率（%）空白對照組甘草組傳統法炮制人中黃組新法炮制人中黃高劑量組新法炮制人中黃中劑量組新法炮制人中黃低劑量組給藥劑量（g·kg-1·d-1）扭體反應（次）10 10 10 10 10 10-1.3 1.3 2.6 1.3 0.65-6.23 29.67 49.02 43.77 25.25

2.2 對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 與空白對照組比較，甘草組對二甲苯致小鼠耳腫脹有較明顯的抑制作用（P<0.05），傳統法炮制人中黃組和新法炮制人中黃中劑量組則未顯示抑制作用。

表2 對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 （）

表2 對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 （）

注：與空白對照組比較，1)P＜0.01

組別 只數 腫空白對照組甘草組傳統法炮制人中黃組新法炮制人中黃高劑量組新法炮制人中黃中劑量組新法炮制人中黃低劑量組給藥劑量（g·kg-1·d-1）腫脹度（mg）10 10 10 10 10 10-1.3 1.3 2.6 1.3 0.65 15.60±1.90 10.45±2.881)17.36±7.53 10.85±2.981)17.24±2.96 17.78±4.82脹抑制率（%）-33.01-11.30 30.45-10.50-13.94

2.3 對氨水致小鼠咳嗽的影響 與空白對照組比較，甘草組（P<0.001）、傳統法炮制人中黃組（P<0.05）、新法炮制人中黃中劑量組（P<0.001）咳嗽次數均顯著減少，咳嗽抑制率以新法炮制人中黃中劑量組最高，且鎮咳作用與給藥劑量呈現一定的正相關性。與甘草組比較，傳統法炮制人中黃組鎮咳作用顯著減弱（P<0.001），新法炮制人中黃中劑量組鎮咳作用無顯著差異（P>0.05）。與傳統法炮制人中黃組比較，新法炮制人中黃中劑量組咳嗽次數顯著減少（P<0.001）。與空白對照組比較，各給藥組咳嗽潛伏期無顯著差異（P>0.05）。

表3 對氨水致小鼠咳嗽的影響 （）

表3 對氨水致小鼠咳嗽的影響 （）

注：與空白對照組比較，1)P＜0.05，2)P＜0.001；與甘草組比較，3)P＜0.001；與傳統法炮制人中黃組比較，4)P＜0.05，5)P＜0.001

咳嗽抑制率（%）-56.15 20.35 61.73 56.79 40.10組別 只數 給藥劑量（g·kg-1·d-1）咳嗽潛伏期（s）空白對照組甘草組傳統法炮制人中黃組新法炮制人中黃高劑量組新法炮制人中黃中劑量組新法炮制人中黃低劑量組10 10 10 10 10 10-1.3 1.3 2.6 1.3 0.65 42.45±8.82 51.20±24.09 37.46±8.79 53.39±28.85 71.65±23.46 71.98±31.23咳嗽次數（次）20.25±6.16 8.88±3.402,5)16.13±4.161,3,5)7.75±2.442,5)8.75±3.062,5)12.13±2.482,4)

3 討論

實驗前期研究[8]，通過比較12批市售人中黃樣品和甘草中6種主要化學成分的含量，發現甘草素、異甘草素、甘草查爾酮A、甘草次酸為升高類成分，甘草酸和甘草苷為降低類成分；陳永強等[11]通過篩分到的一株產β-葡萄糖醛酸酶的黃曲霉HC-12對甘草進行液體發酵轉化，表明甘草經黃曲霉HC-12轉化作用后，甘草中的甘草酸水解為甘草次酸，動物藥效學實驗說明發酵后甘草的抗炎、鎮痛活性較未發酵甘草有顯著性提高；潘瓊等[3]實驗發現甘草甜素具有顯著的抗炎鎮痛作用，而甘草甜素為甘草酸的鉀、鈣鹽，分解可得到甘草次酸；甘草酸類藥物在人體內的代謝過程已比較清楚，該類藥物經胃酸水解或經肝中β-葡萄糖醛酸苷酶 (glucuronidase)分解為甘草次酸，接著在肝腸循環中經腸內菌作用部分生成3-表-甘草次酸及少量的3-脫氫甘草次酸而起藥理活性，故甘草酸類藥物起藥理功效的成分實質上是甘草次酸[12]。本研究醋酸扭體實驗中，同等劑量下比較，傳統法炮制人中黃組（P<0.01）、新法炮制人中黃中劑量組（P<0.001）鎮痛作用均顯著強于甘草組。綜上，說明甘草炮制為人中黃后鎮痛作用顯著增強，與人中黃中甘草次酸含量的升高有關。

傳統人中黃是將甘草粉末搗實于竹筒內，密封晾干，沉于糞便池池底約60 d后清水沖洗至無異味，曝曬。便池中因有銨根離子而呈弱堿性，這與以天然甘草提取出甘草酸，再通氨生成甘草酸三銨、甘草酸單銨或甘草酸二銨相類同。二銨鹽能使甘草酸在葡萄糖醛酸酶的作用下生成甘草次酸更容易，從而提高了甘草酸轉化為甘草次酸的比率，甘草酸為五環三萜類齊墩果酸型結構，無論是α體還是β體，其苷元甘草次酸抗病毒、抗炎作用比甘草酸的活性強得多[13]。故人中黃無論新老炮制方法，均提供氨堿環境，促進了甘草酸銨的生成，為甘草酸進一步轉換為甘草次酸發揮藥理作用奠定了基礎。人中黃主要用于天行熱、瘟毒、痰火、痘疹等熱癥，傳染性、病毒性疾病。天行熱，即溫病，系指感受溫邪所引起的一類外感急性熱病的總稱；瘟毒，瘟疫病邪中具有毒性者；痰火，體內痰濁與火邪互結或痰濁郁久化火的病理變化；痘疹，因患天花出現的皰疹。實驗結果顯示，甘草經新法及傳統法炮制為人中黃后，抗炎作用不明顯，鎮咳作用不顯著，可能與人中黃功效應用與甘草相比發生了變化有關。對人中黃藥性及功效的探究尚需進一步研究。