不同三葉青提取物體外抗腫瘤細胞作用研究※

邱模昌 徐子金 楊章堅

（江西醫學高等?？茖W校藥學系，江西 上饒 334000）

三葉青 (Tetrastigmatis hemsleyani)為葡萄科植物三葉崖爬藤的塊根或全草，別名為金線吊葫蘆、絲線吊金鐘、三葉扁藤等[1]，為江西省道地藥材。近年來，對于三葉青抗腫瘤活性研究較多，三葉青黃酮能顯著地抑制肺癌A549細胞、SGC-7901胃癌細胞、及SMMC-7721肝癌細胞的生長，并且具有濃度依賴性[2-4]。三葉青乙酸乙酯提取物能有效抑制結腸癌HT-29細胞、白血病HL60細胞、頸癌Hela細胞[5-7]的增殖。三葉青乙醇提取物在一定濃度范圍內能抑制惡性黑色素瘤A375細胞的增殖，且呈劑量依賴關系[8]。三葉青水提物及其含藥血清對人胃腺癌細胞AGs細胞均有較強抑制作用，并且其抑制作用呈現出劑量依賴性[9]。三葉青各種方式的提取物體外抑制腫瘤作用均有報道，對其抗腫瘤活性差異尚未有具體研究。通過采取水、乙醇、乙酸乙酯三種不同的溶劑對三葉青進行提取，檢測三葉青不同方式提取物的含藥血清體外對乳腺癌細胞（MCF-7）存活率及凋亡的影響，根據不同提取方式對腫瘤細胞存活率及凋亡作用的差異，確定抑制腫瘤活性最強的提取方式，為明確三葉青抗腫瘤的具體成分提供依據。

1 材料

1.1 藥材 三葉青購自上饒市中醫院，經江西醫學高等?？茖W校藥學系汪亮副教授鑒定為Tetrastigma hemsleyanum Diels et.Gilg。

1.2 細胞 人乳腺癌細胞（MCF-7）購自上海美軒生物科技有限公司。

1.3 儀器與試藥 ELX800酶標儀（美國Biotek公司），H4-2000倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司），Annexin HS-1300-U超凈工作臺（山智精密儀器科技有限公司），MCO-18AC CO2培養箱（日本三洋公司），SY-5000旋轉蒸發器（上海圣科儀器設備有限公司）。MTT(美國，Amresco公司)，RPMI 1640培養基 (美國，Invitrogen公司)，胎牛血清 (上海藍季科技發展有限公司)，V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司），水、95%乙醇、乙酸乙酯、DMSO均為分析純。

2 方法

2.1 三葉青提取物溶液的制備 取三葉青飲片適量，分別加適量的水、95%乙醇、乙酸乙酯作為提取溶劑，回流提取3次，每次1 h，合并提取液，過濾，濾液濃縮干燥，得三葉青水提取物浸膏、乙醇提取物浸膏、乙酸乙酯提取物浸膏。取3種浸膏適量，用1 mL DMSO溶解，用含10%(體積分數)滅活新生小牛血清RPMI-1640培養液稀釋，分別配制成10、50、250、500、1000 μg.mL-1溶液，備用。

2.2 細胞培養 取對數生長期的MCF-7貼壁細胞制成1×104個·mL-1單細胞懸液，接種于96孔培養板，每組設6個平行孔，每孔100 μL，24 h后吸棄原培養基，換用含1%胎牛血清的DMEM培養備用。

2.3 MTT法檢測三葉青提取物對MCF-7細胞存活率的影響

2.3.1 3種不同濃度提取物對存活率的影響 將備用MCF-7細胞分成6組，設對照組和實驗組。對照組培養基不加任何藥物；實驗組分別加入不同濃度三葉青水提取物溶液、乙醇提取物溶液、乙酸乙酯提取物溶液，使其終濃度分別為2、10、50、100、200 μg·mL-1。上述各組細胞培養24 h后，加入5 mg·mL-1濃度MTT溶液每孔15 μL，孵育4 h后吸棄上清。每孔加入DMSO 150 μL，室溫下放置30 min，振蕩5 min，使結晶物充分溶解，選擇490 nm波長，在酶標儀上測定吸收值，記錄OD值為結果。

2.3.2 3種提取物對MCF-7細胞凋亡的影響 采用流式細胞Annexin V-FITC/PI雙染法檢測MCF-7細胞凋亡率。將備用MCF-7細胞分成4組，分別是：①對照組：培養基不加任何藥物；②水提物組：加入三葉青水提取物溶液，使其終濃度為200 μg·mL-1；③乙醇組：加入三葉青乙醇提取物溶液，使其終濃度為200 μg·mL-1；④乙酸乙酯組：加入三葉青乙酸乙酯提取物溶液，使其終濃度為200 μg·mL-1。上述各組培養24 h后采用不含DMEM的0.25%胰酶消化收集細胞，用PBS洗滌細胞2次，1000 r·min-1離心5 min，吸棄上清液，然后加入400 μL結合緩沖液重懸細胞。分別加5 μL Annexin VFITC和5 μL PI避光反應10 min，立即用FACScan進行流式細胞術定量檢測， FITC+/PI-的細胞為凋亡細胞，凋亡細胞占總細胞數為細胞凋亡率。

2.4 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，計量資料用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準取α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 不同濃度三葉青提取物對MCF-7細胞存活率的影響 3種不同提取物，以各自對照組OD值為標準，對應存活率為 (100±0)%，實驗組按照OD值與對照組OD值比值計算其相對存活率。經MTT法檢測細胞存活率發現，三葉青的水、乙醇、乙酸乙酯提取物溶液，除低濃度（2 μg·mL-1、10 μg·mL-1）水提取物外，均能使MCF-7細胞存活率下降（P<0.05），且其對存活率的降低作用與提取物濃度成正相關；相同濃度下，3種提取物對MCF-7細胞存活率的降低作用依次是乙酸乙酯提取物>乙醇提取物>水提取物（見表1、圖1）。

表1 不同濃度、不同提取方式三葉青提取物對MCF-7細胞存活率的影響 （，%）

表1 不同濃度、不同提取方式三葉青提取物對MCF-7細胞存活率的影響 （，%）

注：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；n=6

提取物濃度（μg·mL-1）0（對照組）2 10 50 100 200 MCF-7細胞存活率水提取物溶液 乙酸乙酯提取物溶液乙醇提取物溶液100±0 89.82±2.04 91.74±1.98 85.15±3.52 76.45±3.60 75.20±4.26 100±0 75.74±3.54 65.32±4.21 64.06±4.86 58.29±4.77 54.47±5.91 100±0 77.04±4.19 70.60±4.73 60.42±5.10 45.61±5.45 40.33±6.49

圖1 不同濃度、不同提取方式三葉青提取物對MCF-7細胞存活率的影響

3.2 不同三葉青提取物對MCF-7細胞凋亡的影響 采用流式細胞Annexin V-FITC/PI雙染法對三葉青的水、乙醇、乙酸乙酯3種提取物在高濃度（200 μg·mL-1）下影響MCF-7細胞凋亡的效果進行了檢測。結果顯示水提物組、乙醇組較對照組細胞凋亡率明顯提升（P<0.05）；乙酸乙酯組較對照組細胞凋亡率顯著提升（P<0.01）；乙酸乙酯組較水提物組、乙醇組，前者具有更強的促進MCF-7細胞凋亡的作用（P<0.05），見表2。

表2 不同三葉青提取物對MCF-7細胞凋亡的影響

4 討論

江西省中草藥資源豐富，通過對中草藥提取成分的研究有利于充分發掘中藥治療腫瘤的潛在作用。為中藥抗腫瘤作用提供科學、客觀的理論依據。三葉青作為近年研究較多的抗腫瘤中藥材之一，其體內外抑制肺癌、胃癌、肝癌、結腸癌、黑色素瘤等均有報道。乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤，在我國乳腺癌發病率也居女性惡性腫瘤之首，且仍在快速增長[13]。研究結果顯示，三葉青3種提取方式的提取物，在較高濃度（50 μg·mL-1）下，共同培養24 h，均能不同程度地降低MCF-7細胞存活率，在高濃度（200 μg·mL-1）下，能使MCF-7細胞早期凋亡率明顯提高。這說明3種提取方式的三葉青提取物均具有體外抗乳腺癌MCF-7細胞作用，其機制可能與促進癌細胞凋亡有關。

三葉青的主要有效成分包括黃酮類、三萜及甾體類、酚酸類、脂肪酸類化合物等，其中黃酮類成分為主要抗腫瘤活性成分[14]。不同濃度三葉青提取物對MCF-7細胞存活率的影響結果中發現，3種提取物在50 μg·mL-1（或更高）濃度下，對癌細胞的抑制作用呈現出較大差距，其中乙醇提取物和乙酸乙酯提取物對MCF-7細胞的抑制作用要高于水提取物。在50 μg·mL-1（或更高）濃度下，乙酸乙酯提取物的作用又明顯強于乙醇提取物。3種高濃度（200 μg·mL-1）三葉青提取物對MCF-7細胞凋亡的影響均有較大的差異，對細胞凋亡的影響乙醇提取物>乙醇提取物>水提取物。這說明三葉青的乙酸乙酯提取物是三種提取物中抗腫瘤作用最強的。三葉青乙酸乙酯提取物中具體抗腫瘤的成分及作用機制還有待進一步研究。