純鎂超聲微弧氧化—硅烷—黃芪甲苷復合處理層的細胞相容性

孫勝磊 李德超 李慕勤 戴驍焱 張慧明 彭書浩

摘 要：目的 為了調節純鎂的降解性與提高生物活性，對其表層采取超聲微弧氧化（UMAO）、硅烷化、載黃芪甲苷復合處理方法，分析各種處理方法對成骨細胞生物相容性的影響大小。方法 以純鎂微弧氧化UMAO為對照組（A組），純鎂微弧氧化UMAO-硅烷（B組），純鎂微弧氧化UMAO-硅烷-100 μg/ml黃芪甲苷（C組）為實驗組，通過Cell Counting Kit（CCK-8）試劑盒、掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡等方式檢測不同處理膜層細胞相容性。結果 CCK-8粘附與增殖實驗測定的吸光率C組超過B組，B組超過A組，膜層表層細胞粘附及增殖隨著時間的推移呈現出不斷增加的趨勢，其中純鎂微弧氧化UMAO-硅烷-100 μg/ml黃芪甲苷復合膜層具有最優的成骨細胞活性，并具有統計學意義（P>0.05）。結論 純鎂微弧氧化UMAO-硅烷-100 μg/ml黃芪甲苷復合處理后膜層的細胞相容性最好，純鎂微弧氧化UMAO-硅烷處理次之，純鎂UMAO組最低。

關鍵詞：純鎂；超聲微弧氧化；硅烷；黃芪甲苷；細胞相容性

中圖分類號：R318.08 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.09.024

文章編號：1006-1959（2018）09-0079-05

Abstract：Objective To regulate the biodegradability of pure magnesium and to improve its bioactivity， ultrasound microarc oxidation （UMAO），silanization and astragaloside loading were used to treat the surface layer of magnesium，and the effects of various treatments on the biocompatibility of osteoblasts were analyzed.Methods Microarc oxidation of pure magnesium（UMAO）was used as control group（group A），magnesium microarc oxidation of UMAO- silane（group B），pure magnesium microarc oxidation UMAO- silane -100μg/ml astragaloside（group C）was the experimental group.The compatibility of different treatment membrane cells was detected by Cell Counting Kit（CCK-8）kit，scanning electron microscope and laser confocal microscope.Results The absorbance measured by CCK-8 adhesion and proliferation assays in group C surpassed group B，and group B surpassed that in group A.The adhesion and proliferation of surface layer cells in the membrane layer are increasing with time，in which pure magnesium microarc oxidation UMAO-silane-100μg/ml astragaloside composite membrane has the best osteoblast activity，and has statistical significance（P>0.05）.Conclusion After the pure magnesium microarc oxidation UMAO-silane-100μg/ml astragaloside composite treatment，the cytocompatibility of the membrane was the best，the pure magnesium micro arc oxidation UMAO-silane treatment was the second，the pure magnesium UMAO group was the lowest.

Key words：Pure magnesium；Ultrasonic microarc oxidation；Silane；Astragaloside；Cytocompatibility

純鎂可作為一種良好的可以降解的醫用植入金屬材料，純鎂有著的降解性與良好的力學特征，具有十分關鍵的優勢地位。近些年來，醫用植入材料很大程度的采用了純鎂作為植入材料的第一選擇[1-3]。在體內的生理環境中純鎂易發生降解，這種自動降解的優異性能滿足了不需要二次手術將其取出，且純鎂在人體內的降解產物也沒有毒副作用[4]。鎂及其合金力學相容性而言也是非常優異的，能作為一些支撐的骨骼材料，或者骨釘應用于臨床醫學中去，為有需要的患者提供支撐；純鎂也具有非常良好的生物相容性，這使得在以純鎂作為植入材料植入到生物體內后，生物體并不會發生特別強烈的排異反應[5]。但純鎂在體內降解速率高于骨生長速率，如何降低降解速率，使之達到與骨生長匹配成為研究關鍵問題。微弧氧化處理，是一種通過高壓利用等離子放電的陽極氧化的方法[6]。純鎂表面通過微弧氧化（MAO）技術可在純鎂表面形成嚴密多孔隙的薄氧化鎂陶瓷層，提高純鎂表面的耐腐蝕性[7-9]。但微弧氧化表面多孔有的呈貫穿性，使體液直接浸入，發生點蝕。對硅烷采取金屬預處理是近些年以來主流的表面處理方法[10]。硅烷預處理的機理其實是硅烷分子水解后生成的硅羥基與金屬氧化物反應形成無機膜，使金屬表面形成一種具有疏水性的膜。這種有機膜層能夠保護金屬基體與外界隔離，因其有機膜層的成分特點能夠很好的與生物基體結合[11]。據臨床和實驗研究發現黃芪甲苷具有抗炎、促進骨細胞生長、降低血糖和改善心腦血管疾病等杰出的生物活性 [12]。另據實驗研究顯示，適宜濃度的黃芪甲苷可顯著促進人體內骨髓間充質干細胞的增殖[13]。對成骨細胞進行體外培養，觀察黃芪甲苷對成骨細胞增殖和分化的作用，濃度適宜的黃芪甲苷溶液對成骨細胞有促進增殖與促進分化的作用，具有促進其骨形成作用[14]。

利用純鎂的可降解性和良好的力學特性等優異特點，以控制鎂的降解速率為重點，對純鎂進行微弧氧化處理，并提出硅烷中添加黃芪甲苷設計的思路。含有黃芪甲苷硅烷水解液可浸漬微弧氧化孔隙實現減少貫穿孔隙的作用，進而控制鎂降解速率，而黃芪甲苷具有促進成骨細胞增殖和分化的作用，使純鎂表面形成生物性膜層。本文通過細胞毒性實驗黃芪甲苷的最佳濃度，采取對比分析方法，探討純鎂微弧氧化膜層、純鎂微弧氧化-硅烷膜層、純鎂微弧氧化-硅烷-載100 μg/ml黃芪甲苷膜層細胞膜層對成骨細胞增殖、分化及活性的影響，為純鎂及其合金在醫學領域的臨床應用提供充分而有說服力的依據。

1材料與方法

1.1實驗材料與設備

1.1.1菌株和試劑 MC3T3-E1細胞株（中科院上海細胞庫），純鎂（其中純度超過99.9%，直徑10 mm，厚1 mm），赫斯特Hoechest熒光染料（北京索萊寶），CCK8試劑盒（日本同仁），鬼筆環肽（上海祤圣生物公司），抗熒光淬滅液（Beyotime）。PBS離子緩沖液，10%胎牛血清（NQBB），胰蛋白酶（HyClone），青霉素-鏈霉素溶液（雙抗），α-MEM培養基，硅烷，黃芪提取物黃芪甲苷。

1.1.2儀器 Air Tech凈化工作臺，激光共聚焦顯微鏡（Olympus公司），Hepa Class 100型CO2培養箱，（E）型4 ℃冰箱，YXQSG41.280型手提式壓力蒸汽滅菌鍋，-80 ℃冰箱，酶聯免疫檢測儀，AL204電子天平，SZ-100自動三重純水蒸餾水（上海亞榮生化儀器廠），培養箱（美國Sheldom公司），掃描電子顯微鏡（JSM-6360LV），超聲微弧氧化（UMAO）實驗儀器（哈爾濱工業大學先進涂層技術實驗室生產），KQ-50型醫用數控超聲儀（昆山超聲波儀器有限司）。

1.2試件制備及分組

1.2.1鎂片表面涂層制備 試件均采用厚度1 mm，直徑10 mm的純鎂材料，500目、800目、1000目、1500目砂紙打磨，蒸餾水清洗晾干。將微弧氧化設備的參數設定為頻率為500 Hz，脈沖寬度為50 μs，電壓恒定為300 V，將純鎂試樣作為正極，不銹鋼電解槽為負極，將硅酸鹽電解液放入超聲波儀器中微弧氧化10 min，蒸餾水清洗晾干。

配制硅烷水解溶液，硅烷偶聯劑KH-550∶H2O∶乙醇=1∶10∶1，將微弧氧化后試樣進行硅烷封孔處理。在配制的硅烷水解液中添加100 μg/ml黃芪甲苷，配制成含黃芪甲苷硅烷水解溶液。將微弧氧化后鎂試件分別懸吊于硅烷水解液和含甲苷硅烷水解溶液中，每隔30 s進行提拉一次并拋干，將上述操作重復3次后，將試件拿出快速甩干，制出復合膜層。

1.2.2實驗分組 實驗總共分成三個小組，純鎂微弧氧化是屬于A組，即所謂的對照組；微弧氧化后載硅烷為B組；微弧氧化硅烷處理后載100 μg/ml黃芪甲苷為C組。

1.3實驗方法

1.3.1細胞毒性實驗 為了確定黃芪甲苷的最佳加入濃度，設置對照組（0 μg/ml）、0.1 μg/ml、1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml、1000 μg/ml黃芪甲苷培養液六組實驗組，對照組為0 μg/ml的黃芪甲苷培養液，每組三個復孔。取3個96孔板分別用于3個時間點，常規培養MC3T3-E1細胞至對數期，制備細胞懸液質濃度為1×104 cells/ml，接種于各組孔板中，將三個96孔板放入培養箱中常規培養24 h后，吸出原培養液，對照組加入200 μl培養液，其余各組分別加入200 μl的0.1 μg/ml、1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml、1000 μg/ml黃芪甲苷培養液，再放入培養箱中分別培育24 h、48 h、72 h之后暫停培育，使用PBS反復清洗3次后，每孔加入100 μl無血清培養基和10 μl CCK-8溶液，其中培養4 h，在酶標儀波長為450 nm時測量A值。

1.3.2掃描電鏡下觀察純鎂表面和進行能譜分析 試件制造完成后，得到本實驗的分組，A組、B組、C組，在試件表面進行噴金處理后，在掃描電鏡下觀察試件表面的微形態，并對其表面進行元素分析。

1.3.3激光共聚焦下觀察細胞形態實驗 將A、B、C三組樣本分別放到24孔板內，細胞接種濃度為5×104 cells/ml濃度接種到三個小組材料表層，恒溫培養箱主要培育12 h、24 h，0.5 ml/孔，4%的多聚甲醛37 ℃固定10 min，PBS洗2次，1 ml/次，0.5 ℃ Triton-X100 1 ml加入24孔中37 ℃，PBS 1 ml清洗2次，棄上清液，加200 μl鬼筆環肽，1 ml/次，PBS洗3次，加Hoechst 0.5 ml，常溫下放置5 min，吸棄Hoechst加入PBS后，取出載玻片將試件放置其上，在試件表面加入抗熒光淬滅試劑，然后轉移至顯微鏡觀測細胞狀態。

1.3.4 CCK-8細胞增殖活性檢測 使用CCK-8方式觀察成骨細胞增殖狀況，細胞接種的方式也是一樣的，各組樣本中分別取12塊放進24孔板中對細胞加以孵育。往往在孵育1 d、3 d、5 d之后拿出每組樣本，不同時間點設定3個復孔，用PBS進行緩慢沖洗，且將其放到全新的24孔板內，根據一定比例添加培養液與CCK-8試劑，然后放進培養箱中孵育2 h之后拿出，然后吸取上清液加入96孔板里，用酶標儀觀察在450 nm波長下方的OD值。

1.4統計學方法 使用SPSS20.0對整體數據加以研究，往往使用二次測量的方差分析方式，各組使用LSD的兩兩對比。數據以（x±s）表示，檢驗水平α=0.05。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2結果

2.1細胞毒性試驗結果 為了確定黃芪的提取物黃芪甲苷的合適加入量，采用CCK-8實驗觀察MC3T3-E1成骨細胞在不同濃度黃芪甲苷處理的24 h、48 h、72 h后細胞毒性，見表1。對照組為不含黃芪甲苷的培養液，低濃度（0.1 μg/ml）組與對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml組和對照組進行對比，在不同的時間差別有著統計學作用。所以，黃芪甲苷加入1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml組都能夠促進成骨細胞的不斷增殖，但最高濃度（1000 μg/ml）組對成骨細胞增殖有一定的約束效果。根據數據分析得出，100 μg/ml組對MC3T3-E1成骨細胞的增殖效果是最高的，因此選取100 μg/ml組作為體外細胞實驗的加入量。

2.2 SEM觀察試件表面形貌并進行元素分析 純鎂表層各種處理膜層SEM外形狀態見圖1。純鎂UMAO組表面有很多細微的小孔。然而純鎂UMAO膜層利用硅烷處理之后，B組與C組材料表層的微小孔隙明顯減少，大多數孔隙均被均勻覆蓋且試件表面比較平整。C組經黃芪甲苷處理之后并沒有影響封孔的效果，還可以見到有白色顆粒狀的黃芪甲苷粘附在表面。這表明通過不同的處理，達到了對膜層表面的封孔作用。

2.3 MC3t3-E1細胞增殖實驗 表2為細胞增殖實驗數值，在三個不同時間節點上，A、B、C組對比差異有統計學意義（P<0.05）。不同小組在各時間節點的差異有統計學意義（P<0.05）。在C組樣本表面細胞孵育1 d、3 d、5 d之后的吸光度值達到0.719、0.831、0.954，皆顯著大于B、C兩組，證明C組細胞增殖情況最佳。

2.4細胞形態觀察 細胞培養24 h后，通過鬼筆環肽熒光染色觀察，各組細胞鋪展較好，但數目差異較大，A組細胞的鋪展跟數量不如B組和C組，B組與C組的細胞間沒有密切的關系，C組的細胞狀態更為明顯，C組細胞為伸展充分，細胞之間關聯緊密，相互聯通，微絲骨架清晰可見，見圖2。

3討論

Correa提出，堿性清洗劑可以盡量保留鎂合金外部較多的堿性羥基，這是為了和酸性硅烷羥基進行有效反應，讓Si-O-Mg融合力更加強大[15，16]。因此，在實驗過程中堿處理是非常關鍵的步驟，硅烷則起到一種“粘接劑”的作用，作為連接微弧氧化后的試件和黃芪甲苷的橋梁，將兩種差異懸殊的材料連接起來，形成一種特殊的生物涂層[17，18]。目前對植入材料進行生物改性主要通過對其表面進行處理或者是將一些有生物活性的高分子材料通過某種方式固定于植入材料表面，同時在這種高分子材料固定于植入材料之后，可以保證植入界面的穩定性，因而這種材料必須有明確的目標性和指向性，可以起到與細胞、組織的中介作用[19]。微弧氧化技術有助于純鎂及其合金植入材料生物性能的提高，使純鎂及其合金的生物穩定性大大提高[20，21]。通過實驗發現，純鎂表面微弧氧化后形成了多孔的生物膜層。以添加黃芪甲苷硅烷為中間層，在微弧氧化的純鎂表面，形成純鎂UMAO-硅烷-黃芪甲苷的復合生物膜層。

在今后的新型種植材料的研發與進展中，要充分考慮到種植材料在骨結合的過程中能否與骨組織的成骨細胞形成良好的生物相容性[22]。通過細胞骨架觀察，黃芪甲苷涂層的表面展現出了比其他兩組更好的生存能力。通過體外細胞實驗，證明了載有黃芪甲苷涂層的生物涂層有著十分優良的細胞相容性。

本次實驗第一次將純鎂微弧氧化、硅烷、黃芪甲苷三種處理相融合，不但加強了純鎂的生物相容性，而且將黃芪甲苷促進細胞增殖粘附的巨大優勢體現出來，為今后純鎂在醫學領域的應用奠定了基礎，同時這些數據對種植義齒的理論總結、實際應用等各方面均具有參考價值。

4結論

純鎂經超聲微弧氧化-硅烷-黃芪提取物黃芪甲苷復合處理后具有良好的細胞相容性，在體外細胞實驗中表現了良好的生物相容性和生物活性，且優于純鎂UMAO和純鎂UMAO-硅烷組，純鎂UMAO-硅烷-黃芪甲苷生物膜層利于成骨細胞的增殖。

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收稿日期：2018-2-22；修回日期：2018-3-23

編輯/楊倩