TOP2A和VEGF在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達及其意義

馬菁雯,趙 艷

(上海市寶山區中西醫結合醫院,上海 201900)

宮頸癌是影響女性健康和生命安全最常見的生殖系統惡性腫瘤之一，其病理過程涉及多基因改變和多發生步驟。拓撲異構酶ⅡA(TOP2A)的表達在血管生成、骨髓造血、能量代謝和腫瘤的發生進展過程中具有重要意義[1]。血管內皮生長因子(VEGF)是刺激腫瘤血管生成最主要的細胞因子之一[2]，可促使宮頸鱗狀細胞癌(CSCC)的快速生長[3]。本研究探索了TOP2A和VEGF在CSCC中的表達情況和臨床意義，現報道如下。

1 臨床資料

1.1一般資料 收集2015年2月—2016年6月我院婦產科64例CSCC組織標本，并經術后病理證實?；颊吣挲g38～70(51.3±9.2)歲，國際婦產科學聯盟FIGO(2009)分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期患者分別為30例、24例和10例。收集22例同時間段在我院婦產門診行宮頸活檢者正常宮頸組織標本，且經病理證實，受檢者年齡32～66(48.2±8.7)歲。所有患者未行術前化療和放療，無其他腫瘤病史。患者均簽署知情同意書。該研究通過我院倫理委員會批準。

1.2方法 分別采用實時定量PCR法和免疫組化方法檢測各標本中TOP2A、VEGF mRNA和蛋白表達情況并進行分析。

1.2.1實時定量PCR 采用TRIzol試劑盒(Invitrogen)提取組織RNA，M-MLV逆轉錄酶(Promega)合成cDNA，ABI Prism 7500序列檢測系統(Applied Biosystems)進行RT-PCR。以β-actin分別作為TOP2A和VEGF PCR標準參照。TOP2A、VEGF、β-actin的反轉錄引物和PCR引物購自廣州Thermo Fisher公司。TOP2A和VEGF相對表達量均采用2(-ΔΔCq)方法檢測。所有實驗獨立重復3次。正反向引物序列如下：TOP2A，5’-CATGCGCTAGACTCCGAGAACA-3’和5’-GCTTTGCGAGCATCCGGTA-3’；VEGF，5’-GAGCCTTGCCTTGCTGCTCTA-3’和5’-CACCAGGGTCTCGATTGGATG-3’；β-actin，5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’和5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’。

1.2.2免疫組化 4%多聚甲醛固定標本后行石蠟包埋并切片，采用Histostain-Plus試劑盒(Invitrogen)進行免疫組化染色，2位獨立雙盲的病理醫生進行顯微鏡下染色結果評估。染色陽性的棕黃色顆粒主要定位于胞漿內，少部分分布于細胞核或細胞膜上。結果判讀：TOP2A和VEGF的陽性信號均主要定位于胞漿內的棕黃色顆粒，少部分定位于細胞核或細胞膜上；TOP2A和VEGF陽性細胞數<5%為“-”，5%～25%為“+”，>25%～50%為“”，>50%為“”，本研究中“-”和“+”屬于低表達，“”屬于中表達，“”屬于高表達。

2 結 果

2.1不同宮頸組織中TOP2A和VEGF mRNA表達情況和相關性 實時定量PCR結果顯示，CSCC組織中TOP2A和VEGF mRNA表達水平明顯高于正常宮頸組織中表達水平(P均<0.05)，見表1。Pearson相關性檢驗發現TOP2A和VEGF mRNA表達具有顯著相關性(r=0.778,P<0.001)，見圖1。

表1 CSCC組織和正常宮頸組織中TOP2A和VEGF mRNA表達水平

圖1 CSCC組織中TOP2A和VEGF mRNA表達Pearson相關性分析

2.2CSCC組織中TOP2A和VEGF mRNA的表達和臨床參數的相關性 CSCC組織中TOP2A和VEGF mRNA的表達與患者年齡無明顯相關性(P均>0.05)，與FIGO分期和淋巴結轉移呈正相關(P均<0.05)。見表2。

2.3不同宮頸組織中TOP2A和VEGF蛋白表達情況及其相關性 免疫組化結果顯示，染色陽性的棕黃色顆粒主要定位于胞漿內，少部分分布于細胞核和細胞膜上，見圖2～11。CSCC組織中TOP2A和VEGF蛋白表達陽性率明顯高于正常宮頸組織中蛋白表達陽性率(P均<0.05)。見表3。

表2 CSCC組織中TOP2A和VEGF mRNA表達與臨床參數關系

注：①與Ⅰ期比較，P<0.05；②與陽性比較，P<0.05。

圖2 TOP2A蛋白在正常宮頸組織中表達情況(×200)

圖3 TOP2A蛋白在CSCC組織中低表達(×200)

圖4 TOP2A蛋白在CSCC組織中中表達(×200)

圖5 TOP2A蛋白在CSCC組織中高表達(×200)

圖6 TOP2A陰性對照(×200)

圖7 VEGF蛋白在正常宮頸組織中表達情況(×200)

圖8 VEGF蛋白在CSCC組織中低表達(×200)

圖9 VEGF蛋白在CSCC組織中中表達(×200)

圖10 VEGF蛋白在CSCC組織中高表達(×200)

圖11 VEGF陰性對照(×200)

項目n免疫組化結果/例-+ 陽性/例(%)TOP2ACSCC組織正常宮頸組織642241822414024060(93.8)①4(18.2)VEGFCSCC組織正常宮頸組織642261812416030058(90.6)①4(18.2)

注：①與正常宮頸組織相比，P<0.05。

2.4隨訪結果 本研究患者隨訪12個月。免疫組化結果中，TOP2A蛋白低表達(-和+)共26例，其中5例死亡，21例存活；TOP2A蛋白中表達()共14例，其中4例死亡，10例存活；TOP2A蛋白高表達()共24例，其中8例死亡，16例存活。而VEGF蛋白低表達(-和+)共18例，其中4例死亡，14例存活；VEGF蛋白中表達()共16例，其中4例死亡，12例存活；VEGF蛋白高表達()共30例，其中9例死亡，21例存活?；谏鲜鲅芯拷Y果繪制Kaplan-Meier生存曲線，表明TOP2A和VEGF蛋白高表達的患者生存率明顯低于陰性表達和低表達的患者，見圖12及圖13。

圖12 TOP2A蛋白不同表達水平的生存率

2.5CSCC組織中TOP2A和VEGF蛋白表達相關性 TOP2A蛋白陽性表達和VEGF蛋白陽性表達之間存在正相關關系(P<0.05)。見表4。

3 討 論

圖13 VEGF蛋白不同表達水平的生存率

TOP是低氧耐受過程中最重要的異源二聚體分子，由α和β亞基構成。α亞基對氧濃度高度敏感，是TOP分子的功能基團和活化基團[4]，而β亞基不受氧濃度的調節，是TOP分子的機構基團。目前已知已分離鑒定出的α亞基包括1α、2α、3α，它們都可與β亞基結合組成二聚體，進而分別組裝成TOP1A、TOP2A和TOP3A。在缺氧條件下，TOP2A蛋白表達受氧依賴性降解域(ODD)調控[5]。然而，在正常氧濃度條件下，TOP2A蛋白易受泛素-蛋白酶體作用而降解。因此，TOP2A在正常機體的組織和細胞內的表達處于低水平狀態。當細胞內氧濃度下降時，TOP2A的降解過程受到抑制，胞漿內TOP2A表達增多[6]，并相繼轉移至胞核內，通過與TOP2A受體結合，啟動靶基因特異序列轉錄表達[7]，發揮其多種生物學功能。在缺氧條件下，TOP家族可調節多種基因的表達[8]，參與腫瘤細胞的增殖、分化、代謝、轉移和血管生成[9-10]。因此，TOP2A可能在腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移中起著促進作用。

已有研究表明，在正常組織和器官中，TOP2A蛋白呈低表達狀態，但是在腫瘤細胞如子宮內膜癌、膀胱癌、腎細胞癌、乳腺癌、肝癌和前列腺癌中TOP2A蛋白表達明顯升高[11]。本研究結果顯示，在CSCC組織中，TOP2A mRNA表達水平和TOP2A蛋白表達陽性率明顯高于正常宮頸組織。這可能跟宮頸鱗狀細胞癌惡性增殖的病理生理過程介導的缺氧機制有關[12-13]。有研究指出，TOP家族通過調控相關靶基因和參與細胞能量代謝介導腫瘤細胞缺氧耐受，從而促進靶基因蛋白如survivin表達，進而增強腫瘤細胞的侵襲能力[14]。在本研究中也發現，淋巴結轉移陽性患者的CSCC組織中TOP2A mRNA表達水平明顯高于陰性患者。

VEGF是腫瘤細胞刺激血管生成的主要細胞因子之一，在細胞缺氧時其表達水平明顯增加。因此，缺氧條件下血管內皮生長因子依賴性血管生成是腫瘤組織生成新生血管的關鍵步驟[15]。許多惡性腫瘤細胞都能具有自分泌VEGF的能力，合成的VEGF能夠誘導血管生成，導致相應的結構和功能異常，從而加速腫瘤的發生和發展。同時，VEGF可增強血管內皮細胞的活性，促進細胞分裂，增加微血管的通透性，促進細胞遷移和抑制細胞凋亡[16]。研究發現，在宮頸癌患者血中VEGF水平顯著增加，VEGF可明顯促進宮頸鱗狀細胞癌的血管生成[17]。本研究發現，在CSCC組織中，VEGF mRNA的表達水平和VEGF蛋白表達陽性率均明顯高于正常宮頸組織，同其他研究結果一致。

既往研究發現，高表達的TOP2A可增加腫瘤細胞VEGF的合成[18]。本研究結果顯示，在CSCC組織中TOP2A和VEGF mRNA的表達水平均明顯高于正常宮頸組織，并且TOP2A的表達與VEGF的表達有顯著正相關性。有研究發現，在CSCC組織中TOP2A呈高表達狀態，并且與放療敏感性密切相關[19]。本研究結果顯示，在CSCC組織中，TOP2A和VEGF mRNA表達水平與患者年齡無明顯相關性，而與FIGO分期和淋巴結轉移有顯著相關性。部分研究發現TOP2A可能在部分腫瘤具有特異性，例如TOP2A在小細胞肺癌(SCLC)患者體內呈低表達，且不影響腫瘤細胞的存活時間[20]；而非小細胞肺癌(NSCLC)患者高表達TOP2A，生存時間顯著縮短，這表明TOP2A可能是一個獨立的影響患者預后的指標[21]。TOP2A可結合VEGF基因啟動子[18]，增加VEGF mRNA的表達。高表達的VEGF促進了血管內皮細胞的分裂、增殖和遷移，促進血管新生，從而在一定程度上改善腫瘤組織的缺氧狀態。本研究結果顯示，宮頸鱗狀細胞癌組織中TOP2A和VEGF mRNA的高表達可能預示著宮頸癌淋巴結轉移的高風險。通過繪制Kaplan-Meier生存曲線，筆者發現TOP2A和VEGF蛋白高表達的患者總體生存率明顯差于陰性表達和低表達的患者，推測宮頸鱗狀細胞癌患者的臨床FIGO分期可能與生存率有一定相關性。

綜上，高表達的TOP2A可能通過調節VEGF的表達，參與CSCC的發生、發展、侵襲和轉移。而在正常的宮頸組織中，TOP2A和VEGF呈低表達狀態。這為CSCC的預防和治療提供了新的思路。