復方白花蛇舌草對肝癌細胞增殖和凋亡的影響

楊 弘 ，靳祎祎 ，林露敏 ，林 珊 ，3，魏麗慧 ，3，林久茂 ，3

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州350122；2.福建中醫藥大學中醫學院，福建 福州350122；3.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122）

肝癌作為世界上的一種惡性腫瘤，其發病率和死亡率高，嚴重危害了人類健康［1］。據統計，在惡性腫瘤中，我國肝癌患者每年的病死率居第二位［2］。臨床上，肝癌的主要治療方法是手術以及放化療，但是在接受了手術治療后，還有50%以上的患者會發生腫瘤的復發及轉移，同時，雖然化療對腫瘤的發展能夠有效的控制，但化療明顯降低了患者的生存質量及其產生的如胃腸道不適、骨髓抑制、脫發等毒副作用不可小覷［3］。因此，現代醫學治療肝癌的局限性使得開發療效確切、毒副作用小的抗腫瘤藥物成為了當今國內外研究的重點。本研究通過體外培養肝癌細胞觀察復方白花蛇舌草（hedyotis diffusa willd formula，HDWF）對肝癌細胞增殖的抑制作用及對肝癌細胞凋亡的誘導作用，為其臨床治療腫瘤提供理論根據。

1 材料與儀器

1.1 藥物與細胞株 復方白花蛇舌草生藥材購自福建中醫藥大學附屬第三人民醫院；肝癌細胞株（Bel-7402、SK-Hep-1）購自南京凱基生物科技發展有限公司。

1.2 試劑與材料 DMEM、RPMI 1640培養基、雙抗（青霉素、鏈霉素）、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶（trypsin）、二甲亞砜（DMSO）購自美國 Gibco公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）干粉（北京索萊寶科技有限公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，美國Hyclone公司）；Annexin V／PI染色試劑盒（南京凱基生物技術發展有限公司）。

1.3 實驗儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設備公司）；CO2培養箱、－80℃超低溫冰箱（美國Thermo公司）；倒置顯微鏡系統（德國Leica儀器有限公司）；形態學顯微圖像分析系統LAS V4.1 Countes?全自動細胞計數儀（美國 Life公司）。

2 實驗方法

2.1 復方白花蛇舌草乙醇提取物的制備 取HDWF（白花蛇舌草、半枝蓮、炙黃芪、炒麥芽各125 g）加入70%乙醇5 kg，浸泡30 min，加熱回流提取 1 h，濾過；藥渣加入70%乙醇5 kg，再加熱回流提取1 h，濾過；合并濾液，減壓（-0.09 MPa、50 ℃）濃縮至稠膏 15 g，減壓（-0.09 MPa、50 ℃）干燥，粉碎，得干粉約90 g。先用PBS配成200 mg／mL，放入-20℃ 貯存備用；超聲30 min助融，用0.45 μm過濾器過濾，再用培養基配成所需要的濃度。

2.2 細胞培養 將肝癌細胞株 Bel-7402、SKHep-1分別置于含 10%滅活 FBS、100 U／mL青霉素和100 μg／mL鏈霉素的DMEM和RPMI 1 640完全培養基中，置于37℃、5%CO2和飽和濕度的細胞培養箱中培養。細胞單層貼壁生長，當匯合度至80%～90%時，加入1 mL的胰蛋白酶（含0.25%EDTA）消化后，加入2 mL完全培養基中和以終止消化，1 000轉／min離心 3 min，棄上清，收集沉淀細胞，用完全培養基重懸制成新細胞懸液后傳代。

2.3 MTT法檢測細胞增殖 取對數生長期的Bel-7402和SK-Hep-1肝癌細胞，接種于96孔培養板中，調整細胞密度為 1×105個／mL，每孔 100 μL，置37℃、5%CO2培養箱中培養。當細胞匯合度達到50%～60%時，棄掉原培養基，分別加入含有不同濃度 HDWF（終濃度分別為 0.0、0.5、1.0、1.5 mg／mL）的培養基，每孔 100 μL，分別干預 24 h和 48 h后吸棄各孔溶液，每孔加入 0.5 mg／mL的MTT溶液100 μL，37℃孵育4 h后吸棄各孔中的液體，加入DMSO 100 μL／孔，室溫靜置 10 min，充分振蕩混勻，使結晶柴充分溶解并混勻。采用全自動酶標儀于570 nm波長處測定各組吸光度值（A值），并計算細胞生長抑制率。

細胞生長抑制率／%＝（1－實驗組A值／對照組A值）×100%。

2.4 細胞形態觀察與計數 將對數生長期的Bel-7402和SK-Hep-1肝癌細胞按2.5×105個／孔的密度接種于6孔板中，于細胞培養箱中培養過夜，待細胞匯合度達到60%時，用不同濃度HDWF（0.0、0.5、1.0、1.5 mg／mL）干預 24 h，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化并拍照記錄。拍照后細胞予消化、中和、離心、重懸處理，臺盼藍染色，于Countes?全自動細胞計數儀對兩株細胞進行計數分析。

2.5 細胞集落形成能力分析 Bel-7402和SKHep-1肝癌細胞以2.5×105個／孔接種于6孔板，置于37℃細胞培養箱中培養過夜，待細胞匯合度達到50%～60%時，加入不同濃度 HDWF（0.0、0.5、1.0、1.5 mg／mL）干預 24 h。 吸棄培養液，用 1 mL PBS清洗，經過消化、中和、離心、重懸操作，將細胞按500個細胞／孔接種于12孔板中，2～3 d換液，且換液前于倒置顯微鏡下觀察細胞狀態，連續培養7～10 d后，當培養板孔中出現肉眼可見克隆時，停止培養。吸棄上清，用PBS清洗2～3次，加入4%多聚甲醛固定15 min，用PBS清洗3遍，最后加入結晶紫染色液染色20 min后用超純水清洗4～5遍，相機拍照觀察細胞集落形成情況。

2.6 Annexin-V／PI染色檢測細胞凋亡 Bel-7402和SK-Hep-1肝癌細胞以2.5×105個／孔接種于6孔板，置于37℃細胞培養箱中培養過夜，待細胞匯合度達到50%～60%時，加入不同濃度HDWF（0.0、0.5、1.0、1.5 mg／mL）干預 24 h 后，收集細胞；然后加入 Annexin V／FITC 和 PI各 5 μL，避光染色 15 min后，流式細胞儀檢測細胞早期凋亡、晚期凋亡及總凋亡情況。

2.7 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件進行數據處理。計量資料符合正態分布以（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗。

3 結 果

3.1 HDWF對Bel-7402、SK-Hep-1肝癌細胞生長抑制的影響 MTT檢測結果顯示：隨著HDWF濃度的升高，Bel-7402和SK-Hep-1肝癌細胞的生長明顯被抑制，具有明顯的劑量依賴和時間依賴作用，與對照組（0 mg／mL）比較差異均有非常顯著性（p＜0.01）。臺盼藍染色計數結果顯示：肝癌細胞Bel-7402和SK-Hep-1經HDWF干預24 h后，細胞數量顯著減少，與對照組比較具有非常顯著性（p＜0.01）。見表 1、表 2。

表 1 HDWF 對 Bel-7402、SK-Hep-1 抑制率比較%

表 1 HDWF 對 Bel-7402、SK-Hep-1 抑制率比較%

注：與對照組比較，1） p＜0.01。

組別對照組實驗組n 8 8濃度 ／（mg／mL）0.0 0.5 1.0 1.5 Bel-7402抑制率 SK-Hep-1抑制率24 h 0.00±1.16 19.19±6.101）28.40±3.391）60.14±2.081）48 h 0.00±3.21 12.38±4.621）46.08±5.801）82.26±2.511）24 h 0.00±3.07 4.60±2.901）62.20±3.311）74.10±1.051）48 h 0.00±2.67 11.50±3.211）76.50±2.301）81.00±1.161）

表 2 HDWF 對 Bel-7402、SK-Hep-1細胞數的影響×106個

表 2 HDWF 對 Bel-7402、SK-Hep-1細胞數的影響×106個

注：與對照組比較，1） p＜0.01。

組別對照組實驗組n 3 3濃度 ／（mg／mL）0.0 0.5 1.0 1.5 Bel-7402 1.36±0.39 1.19±0.451）0.75±0.321）0.59±0.141）SK-Hep-1 1.12±0.36 0.96±0.431）0.73±0.111）0.42±0.241）

3.2 HDWF對Bel-7402、SK-Hep-1肝癌細胞形態的影響 倒置顯微鏡觀察結果顯示：肝癌細胞Bel-7402和SK-Hep-1經不同濃度的HDWF干預24 h后，隨著藥物濃度的增加，Bel-7402和SK-Hep-1細胞密度逐漸減少，懸浮細胞增多，部分細胞皺縮變圓。該結果進一步證實HDWF對Bel-7402和SKHep-1細胞生長具有顯著的抑制作用，并呈明顯的劑量效應，見圖1。

3.3 HDWF對Bel-7402、SK-Hep-1肝癌細胞集落形成能力的影響 集落形成實驗結果顯示：HDWF對肝癌細胞Bel-7402和SK-Hep-1的集落形成能力有明顯的抑制作用，具有一定的劑量依賴性。該結果也進一步證實了HDWF具有顯著抑制肝癌細胞Bel-7402和SK-Hep-1生長的作用，見圖2。

3.4 HDWF對Bel-7402、SK-Hep-1肝癌細胞凋亡的影響 與對照組比較，HDWF各劑量組的早期凋亡率均有明顯增加（p＜0.01），而 HDWF各劑量組的晚期凋亡率及總凋亡率均高于空白組（p＜0.05）。Annexin-V／PI染色結果顯示HDWF具有誘導肝癌細胞Bel-7402和SK-Hep-1凋亡的作用，凋亡細胞數隨著HDWF濃度增加而逐漸增多，呈現明顯的劑量依賴作用，見表3、表4。

圖1 HDWF干預Bel-7402、SK-Hep-1細胞24 h形態圖（×200）

圖2 HDWF干預Bel-7402、SK-Hep-1細胞集落形成染色圖的影響

表3 HDWF對Bel-7402細胞凋亡率的影響%

表3 HDWF對Bel-7402細胞凋亡率的影響%

注：與對照組比較，1） p＜0.01，2） p＜0.05。

組別對照組實驗組n 3 3濃度／（mg／mL）0.0 0.5 1.0 1.5早期凋亡率4.55±0.32 10.16±0.481）23.42±2.111）25.14±2.321）晚期凋亡率0.40±0.19 0.55±0.212）0.81±0.312）2.77±0.901）總凋亡率4.95±0.50 10.61±0.901）24.22±2.321）27.91±2.831）

表4 HDWF對SK-Hep-1細胞凋亡的影響（%

表4 HDWF對SK-Hep-1細胞凋亡的影響（%

注：與對照組比較，1） p＜0.01。

組別對照組實驗組n 3 3濃度／（mg／mL）0.0 0.5 1.0 1.5早期凋亡率0.87±0.19 2.52±0.211）12.24±1.231）11.84±1.041）晚期凋亡率0.35±0.21 2.42±0.271）14.48±2.311）32.36±3.741）總凋亡率1.22±0.25 4.94±0.51）26.72±2.241）44.22±3.801）

4 討 論

近年來，隨著環境、生活方式、飲食習慣等改變，每年我國的肝癌發病率不斷增長。臨床上常規的手術和放、化療都有其局限性，且治療后易復發，對機體的繼發性損傷也很大［4］。目前研究發現：臨床上中醫治療肝癌有一定的優勢，日益受到廣泛關注，已成為醫學研究熱點［5］。肝癌在中醫學中歸屬于“癥瘕、臌脹、痃癖”等病范疇，認為是由于陰陽失調、七情郁結、臟腑受損等因素導致臟腑功能失調，氣血津液運行失常，從而產生氣滯、痰凝、濕濁、熱毒蘊結于臟腑，相互搏結，日久積漸而成的惡性疾病［6］，應治以清熱解毒、扶正祛邪等法［7］。HDWF 具有清熱解毒、益氣健脾消食等功效，方中白花蛇舌草味苦甘，性溫，無毒，歸胃、大腸、小腸經，具有清熱解毒、消癰散結、活血止痛的功效；半枝蓮性味辛、苦、寒，歸肺、肝、腎、大腸經，具有清熱解毒、活血祛瘀、消腫止痛等功能；兩者以藥對方式治療腫瘤，可通過誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖、增強免疫、降低端粒酶等方式達到抗腫瘤目的［8］。炙黃芪健脾補中、升陽舉陷、益衛固表；炒麥芽行氣消積、調節脾胃氣機升降失調；兩藥同用，具有補氣健脾、托毒生肌之功效［9］。

有關研究發現：肝癌之所以難以控制，肝癌細胞的無限增殖是其中的主要原因之一［10］，所以，抑制肝癌細胞的增殖是抑制肝癌發生發展的主要途徑之一。本研究MTT檢測結果顯示：HDWF對肝癌細胞的增殖有明顯的抑制作用，且呈一定的時間和濃度依賴性；同時，細胞計數和細胞形態學觀察也直接、直觀地驗證了這一結論。肝癌細胞的集落形成實驗顯示：HDWF能抑制肝癌細胞集落形成的能力，則進一步驗證了HDWF抑制肝癌細胞的增殖能力。此外，肝癌細胞數的增加也與細胞凋亡密切相關，凋亡的過程是多基因、多途徑參與的復雜過程，某些體內外因素能夠導致細胞中的癌基因以及原癌基因被激活并過度表達，這一過程能夠直接促進肝癌細胞的生長，并且阻斷肝癌細胞凋亡，從而使肝癌細胞大量增加［11］，因此，抑制肝癌發生發展的另一關鍵是誘導肝癌細胞凋亡。本實驗運用的Annexin-V／PI結果顯示：HDWF能夠誘導肝癌細胞的凋亡，且呈劑量依賴性。

綜上所述，HDWF具有抑制肝癌細胞增殖、誘導肝癌細胞凋亡的作用。但肝癌等惡性腫瘤是一種系統性疾病，受到增殖、凋亡相關因子的調控，并與多條相關信號通路的異常活化密切相關，因此HDWF治療肝癌等消化道腫瘤的分子作用機制及其作用靶點研究尚待進一步探討。