澤瀉總三萜的抗炎活性研究

林 娜，黃錦芳，張 雪，羅奮熔，許 文，吳水生

（福建中醫藥大學藥學院，福建 福州350122）

澤瀉是澤瀉科澤瀉屬植物澤瀉Alisma orientale（Sam.） Juzep.的干燥塊莖［1］，具有利尿、降糖、降脂、抗結石等多重作用［2-5］。現代化學研究表明澤瀉的主要化學成分是三萜類化合物［6］，課題組前期開展了澤瀉總三萜部位的富集純化工藝研究，得到總萜含量達到50%以上的三萜部位［7］。現代藥理研究表明澤瀉提取物具有抗炎作用［8-9］，因此本研究采用體內、外炎癥模型評價澤瀉總三萜的抗炎活性，為澤瀉總三萜抗炎作用的現代藥物開發提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 小鼠小膠質細胞株BV-2細胞購于美國APCC公司。

1.2 實驗動物 SPF級雄性NIH小鼠50只，體質量（25±7）g；SPF級雄性 SD 大鼠 50只，體質量（164±39）g，均由廣東省醫學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2013-0002。

1.3 實驗藥物 澤瀉總三萜參照本課題組前期研究的制備方法［7］，由我院中藥藥效物質基礎研究室制備。

1.4 實驗試劑 脂多糖（LPS）、吲哚美辛（美國Sigma公司）；Mouse-IL-6酶聯免疫試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，上海西塘生物科技有限公司）；胎牛血清（FBS）、青鏈霉素混合溶液（PS）、DMEM高糖培養基（美國Hyclone公司）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，天津市福晨化學試劑廠）；二甲苯（廣州市中南化學試劑有限公司）；戊巴比妥鈉（美國Sigma公司）。

1.5 實驗儀器 Infinite M200 Pro多功能酶標儀（瑞士 Tecan公司）；HFU586超低溫冰箱、Primo R臺式冷凍離心機、CO2培養箱（美國Thermo Fisher公司）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；E200生物顯微鏡（日本Nikon公司）；Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）；BS-3000A系列電子天平（上海友聲衡器有限公司）；DHG-9245A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 澤瀉總三萜體外抗炎

2.1.1 澤瀉總三萜的配制 稱取適量的澤瀉總三萜，用 DMSO 配制成濃度分別為 25、50、100 μg／mL的藥液。

2.1.2 細胞培養與處理 BV-2細胞系用DMEM高糖培養基［含1%青鏈霉素混合溶液（PS）、10%胎牛血清（FBS）］于 37℃、5%CO2培養箱中培養，每 1 d傳代1次。

2.1.3 IL-6濃度與吸光度值線性曲線建立 精確稱取IL-6酶聯免疫試劑中的標準品（10 ng），配制出 1 000、500、250、125、62.5、31.3、15.6 pg／mL 的標準品溶液，設置調零孔。于酶標儀450 nm處檢測OD值，建立IL-6濃度與吸光度值線性曲線：y＝0.002 3x＋0.055 7，r值為 0.990 7。

2.1.4 脂多糖（LPS）誘導細胞造模及澤瀉總三萜對IL-6生成的影響 取對數生長期的BV-2細胞以1×105個／mL的密度接種于96孔板中，于細胞培養箱中培養24 h后，每孔加入100 μL不完全培養基。于培養箱中饑餓4 h后，設置分組如下：空白組，無藥物處理；模型組，加入 1 μg／mL LPS；澤瀉總三萜低、中、高劑量組，加入 1 μg／mL LPS 后，分別用 25、50、100 μg／mL 澤瀉總三萜干預；吲哚美辛組，加入 1 μg／mL LPS 后，用 10 μg／mL 吲哚美辛干預。每孔設置3個復孔，干預24 h后檢測細胞上清液中IL-6的表達量，于酶標儀450 nm處檢測其吸光度值，代入線性曲線計算IL-6濃度。

2.2 澤瀉總三萜體內抗炎

2.2.1 澤瀉總三萜的配制 稱取適量的澤瀉總三萜，用0.5%CMC-Na溶液配制成濃度分別為3.6、7.2、14.4 mg／mL 的藥液。

2.2.2 陽性藥物的配制 稱取適量的吲哚美辛，研磨成細粉狀，用0.5%CMC-Na配制成濃度為0.5、1 mg／mL的藥液，分別供小鼠耳輪廓腫脹及大鼠棉球肉芽腫脹試驗。

2.2.3 澤瀉總三萜對二甲苯誘導的小鼠耳輪廓腫脹的影響 NIH小鼠于SPF級動物房中適應性喂養1周后，按體重隨機分為5組，每組10只，即模型組（生理鹽水20 mL／kg），吲哚美辛組（吲哚美辛0.01 g／kg），澤瀉總三萜低、中、高劑量組（澤瀉總三萜 0.072、0.144、0.216 g／kg）， 均分別灌胃給藥，1 d 1次，連續2 d。末次給藥0.5 h后，在小鼠右耳均勻緩慢涂抹二甲苯0.05 mL／只，左耳不涂抹為正常耳。2 h后處死小鼠，沿耳廓基線取下左右耳片，以直徑為0.9 cm的打孔機在左右耳同一部位打下圓耳片并稱重。以每只小鼠兩圓耳片質量差值為腫脹度，計算抑制率，見公式1、公式2。

2.2.4 澤瀉總三萜對大鼠棉球肉芽腫脹的影響SD大鼠于SPF級動物房中適應性喂養1周后，按0.15 mg／100g腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，去毛和局部消毒；切開胸部皮膚，以血管鉗擴充皮下組織，從切口向兩前肢腋下分別塞入25 mg無菌棉球各1個，然后縫合皮膚。術后1 h按體重隨機分為5組，每組 10只，即模型組（生理鹽水 10 mL／kg）、吲哚美辛組（吲哚美辛0.01 g／kg）、澤瀉總三萜低、中、高劑量組（澤瀉總三萜 0.036、0.072、0.144 g／kg），均分別灌胃給藥，1 d 1次，連續7 d。第8天麻醉放血處死大鼠，剝離棉球肉芽組織，于90°C烘箱中干燥1 h，稱重，計算肉芽組織干重及抑制率，見公式 3、公式 4。

抑制率／%＝［（模型組肉芽組織干重－給藥組肉芽組織干重）／模型組肉芽組織干重］×100% （4）

2.3 統計學方法 數據使用SPSS 16.0軟件進行統計分析。計量資料屬正態分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析檢驗。

3 實驗結果

3.1 澤瀉總三萜對BV-2細胞IL-6炎性因子分泌的影響 見表1。

表1 澤瀉總三萜對BV-2細胞IL-6炎性因子分泌的影響

表1 澤瀉總三萜對BV-2細胞IL-6炎性因子分泌的影響

注：與空白組比較，1） p＜0.01；與模型組比較，2） p＜0.01。

組別空白組模型組吲哚美辛組低劑量組中劑量組高劑量組LPS 藥物濃度／（μg／mL）—＋＋＋＋＋——1 0 25 50 100 IL-6 濃度 ／（pg／mL）165.0±12.4 378.2±13.91）179.4±22.52）359.0±21.7 303.2±14.12）213.9±19.52）

3.2 澤瀉總三萜對小鼠二甲苯致耳輪廓腫脹的影響 見表2。

表2 澤瀉總三萜對小鼠二甲苯致耳廓腫脹的影響

表2 澤瀉總三萜對小鼠二甲苯致耳廓腫脹的影響

注：與模型組比較，1） p＜0.05。

組別模型組吲哚美辛組低劑量組中劑量組高劑量組n 耳腫脹試驗10 10 10 10 10劑量 ／（g／kg）—0.010 0.072 0.144 0.216腫脹度／mg 29.3±8.4 13.1±8.71）26.1±10.8 20.9±11.8 13.8±8.91）抑制率／%0.0 55.3 10.9 28.7 52.9

3.3 澤瀉總三萜對大鼠棉球肉芽腫的影響 見表3。

表3 澤瀉總三萜對大鼠棉球肉芽腫脹的影響

表3 澤瀉總三萜對大鼠棉球肉芽腫脹的影響

注：與模型組比較，1） p＜0.05。

組別模型組吲哚美辛組低劑量組中劑量組高劑量組n 棉球肉芽腫脹試驗劑量／10 10 10 10 10（g／kg）—0.010 0.036 0.072 0.144肉芽組織干重／mg 413.7±122.0 210.0±49.21）341.0±63.1 294.1±110.21）306.9±70.91）抑制率／%0.0 49.2 17.6 28.9 25.8

4 討 論

4.1 本研究通過建立脂多糖誘導的BV-2細胞體外炎癥模型，研究發現澤瀉總三萜高、中劑量組可以顯著降低炎癥因子IL-6的濃度，且低、中、高劑量組作用成劑量相關性，提示澤瀉總三萜在體外能有效抑制炎癥因子，發揮抗炎作用。

4.2 在二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型中，本實驗結果表明澤瀉總三萜高劑量組小鼠的耳廓腫脹度，與模型組比較有顯著性差異（p＜0.05），能有效抑制二甲苯引起的局部組織血管擴張，提示了澤瀉總三萜可以減少炎癥介質的釋放，抑制急性炎癥；在棉球致大鼠肉芽腫脹模型中，澤瀉總三萜中、高劑量組可以顯著減輕大鼠棉球肉芽腫脹程度，提示澤瀉總三萜對炎癥造成的組織增生有抑制作用。結合體內、外抗炎實驗的結果，表明澤瀉總三萜具有較好的抗炎活性。