環介導等溫擴增法檢測結核分枝桿菌的應用

杜偉勤 薛婷 王桂琴

[摘要]目的 建立環介導等溫擴增技術（LAMP）檢測肺結核患者痰液中的結核分枝桿菌（MTB）基因。方法 以結核分枝桿菌高度保守的16S rDNA為靶基因設計3對特異性引物，收集2017年1～12月臨床確診的肺結核患者痰液89份，非肺結核患者痰液20份以及MTB標準菌株（H37RV），建立LAMP方法，并檢測其特異性、靈敏性，以MTB培養結果為金標準，用SPSS13.0數據處理并進行統計學分析。結果 成功建立LAMP檢測痰液中MTB的方法，其特異性為100%，靈敏性為50 copies。在臨床患者痰液檢測中，特異性和靈敏性分別為85.00%、96.63%，與MTB培養結果比較差異無統計學意義（P>0.05）。結論 LAMP檢測MTB特異性和靈敏度高，適用于基層醫療單位MTB的快速檢測。

[關鍵詞]環介導等溫擴增；結核分枝桿菌；檢驗

[中圖分類號] R939.121 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）5（c）-0123-04

Application of loop-mediated isothermal amplification for the detection of mycobacterium tuberculosis

DU Wei-qin1 XUE Ting2 WANG Gui-qin1▲

1.Education and Research Office of Microbiology and Immunology，Shanxi Medical University of Taiyuan City，Shanxi Province，Taiyuan 030001，China；2.Department of Clinical Laboratory，People′s Hospital of Lvliang City，Shanxi Province，Lvliang 033000，China

[Abstract]Objective To establish the loop-mediated isothermal amplification technique （LAMP） for the detection of Mycobacterium tuberculosis （MTB） gene in the sputum of patients with pulmonary tuberculosis.Methods Three pairs of specific primers were designed based on highly conserved 16S rDNA of MTB as the target gene.From January 2017 to December 2017，89 sputum samples from the patients were with clinically diagnosed pulmonary tuberculosis，20 sputum samples from non-tuberculosis patients and the MTB standard strain （H37RV） were collected.LAMP method was established，and its specificity and sensitivity were tested.The MTB culture results were taken as the gold standard.SPSS13.0 was used for data processing and statistical analysis.Results LAMP was successfully established for the detection of MTB in the sputum.Its specificity was 100% and its sensitivity was 50 copies.In the clinical sputum testing，the specificity and sensitivity were 85% and 96.63% respectively.The results were almost identical with those of the MTB culture，the difference was statistically significant （P>0.05）.Conclusion LAMP has high specificity and high sensitivity in the detection of MTB，which is suitable for the rapid detection of MTB in primary medical institutions.

[Key words]Loop-mediated isothermal amplification；Mycobacterium tuberculosis；Test

結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是一種生長緩慢、通過飛沫經呼吸道傳播引起人類結核病的病原菌。世界衛生組織（WHO）2017年的報告[1]指出，結核病仍然是全球頭號傳染病，雖然近年來抗結核進展顯著，但形勢依然嚴峻。2016年我國新增結核病人89.5萬，報告病例78.3萬例。根據《中華醫學會.結核病分冊》對結核病診斷的規定，其診斷方法包括病原學、免疫學、放射學、組織學、分子生物學診斷等，其中病原學診斷是結核病的診斷金標準。但MTB痰涂片檢出率低，培養周期長，不利于早期診斷和預防治療。WHO推薦的PCR法或快速液體培養法需要昂貴設備和嚴格的實驗室條件，廣大基層結核病實驗室條件尚不能滿足此類方法的開展。

環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）為一種新型的核酸等溫擴增方法。這種方法是通過BstDNA鏈置換聚合酶對目的基因的6個不同區域設計的3對引物（內引物、外引物、環引物）在60～65℃恒溫條件下1 h內進行109～1010倍擴增[2-3]。由于其特異性強，擴增效率高，不需要昂貴設備等多方面的優勢備受人們的關注。本研究應用LAMP檢測方法對臨床樣本中的MTB 16S rDNA進行擴增，為其在基層醫療機構中應用奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 本實驗使用的標本均來源于呂梁市人民醫院檢驗科2017年1～12月收集的標本共89例。提供標本的患者均經痰涂片和胸片檢查診斷為結核病。另外收集醫院非結核患者標本的痰液20份，作為陰性對照。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有患者均簽訂《知情同意書》。MTB標準菌株H37RV由呂梁市疾控中心惠贈。

1.1.2主要試劑與儀器 羅琴培養基（珠海貝索生物科技有限公司），甜菜堿（Sigma公司），Bst大片段DNA聚合酶（NEB公司），DNA Marker， dNTP （大連寶生物工程有限公司），SYBR GreenⅠ（Thermo fisher公司），結核分枝桿菌核酸試劑盒（中山大學迪安基因有限公司），恒溫水浴箱（上海精密儀器儀表有限公司），UVP凝膠成像系統（美國BioSpectrum公司）。

1.2方法

1.2.1細菌培養及DNA模板的制備 將痰液分為兩份。一份接種于羅琴培養基上；另一份用4%的NaOH污染。按照MTB核酸檢測試劑盒說明書提取DNA。

1.2.2 LAMP試驗引物 本研究中所用引物是針對MTB 16S rDNA設計3對引物，引物序列參考Pandey等[4]報道。

1.2.3 LAMP反應體系與反應條件 25 μlLAMP 體系包括：外引物（F3和B3）各 0.2 μmol/L，內引物（FIP和BIP）各 1.6 μmol/L，甜菜堿1.6 mol/L，6 mmol/L Mg2SO4，1.4 mmol/L dNTPs，8 U Bst DNA 聚合酶 1 μl、2.5×的buffer，2 μl 模板 DNA。將反應管置于62℃恒溫水浴箱內反應 1 h后，于80℃ 10 min終止反應。

1.2.4 LAMP檢測的特異度 以MTB H37RV為陽性對照，以滅菌雙蒸水為陰性對照，以從臨床非結核病患者中分離的肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、鮑曼不動桿菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌的DNA為模板進行擴增。分別取5 μl擴增產物，于2%瓊脂糖凝膠中電泳后，UVP拍照，出現LAMP 特征性梯狀條帶為陽性結果，無梯狀條帶為陰性結果。

1.2.5 LAMP反應的靈敏度 NanoDrop超微量紫外分光光度計對H37RV的DNA定量測定，雙蒸水調整濃度至1×108/ul，倍比稀釋，以稀釋后梯度DNA為模板，進行LAMP擴增，瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.2.6 LAMP的臨床評價 對臨床收集的89 例MTB患者的痰液DNA和20例非結核病患者的痰液DNA進行LAMP 擴增，將LAMP擴增結果與羅琴培養基培養結果進行一致性比較。一致性評價：Kappa值0.00～0.40為一致性較差，0.41～0.60為一致性一般，0.61～0.80為一致性較高，0.81～1.00為幾乎完全一致。

2結果

2.1 LAMP的特異性

用LAMP檢測MTB H37RV與其他非結核病肺炎患者的痰液結果如圖1所示，可以看出，只有H37RV有梯度條帶出現，其他菌株未出現梯度條帶。綜上此方法在MTB 檢測中具有高度特異性。

2.2 LAMP的靈敏度

將提取的MTB標準菌株的DNA進行倍比稀釋，用LAMP進行擴增，結果如圖2所示。 從圖可知，電泳后的產物呈階梯狀條帶，在第8泳道仍可顯現，說明LAMP的檢測限為50 copies。

2.3 LAMP檢測臨床標本的部分結果

LAMP檢測臨床結核陽性標本的部分結果（圖3），其中7號和10號未出現擴增條帶?？梢曅詸z測結果（圖4）所示：反應管內液體綠色為陽性，橙色為陰性。

2.4 LAMP的臨床評價

對臨床收集的89 例 MTB患者的痰液DNA和20例非結核病患者的痰液 DNA進行LAMP 擴增，將LAMP擴增結果與羅琴培養基培養結果進行一致性比較，所得實驗結果如表2所示，特異性和靈敏性分別為85.00%、96.63%，對這兩種方法經一致性檢驗后比較，差異無統計學意義（P>0.05），由 Kappa值=0.82可知，兩種方法的一致性良好。

3討論

LAMP技術自2000年日本人發明以來，己經在許多領域得到了很好的發展，如大腸桿菌[5]、沙門菌[6]、金黃色葡萄球菌[7]、螺旋體[8]、支原體[9]、病毒[10-11]等病原生物體的檢測文獻相繼被報道。據國內學者胡宗悅報道[12]，在PubMed上發表的關于LAMP的文獻約有1622篇，在CNKI上約為4220篇，可以看出LAMP檢測技術已成為一種工具，廣泛應用于醫療、動植物、基礎、食品水產和環境等方面。與其他技術相比，LAMP檢測技術具有以下優勢：①LAMP檢測技術不像PCR需要變性、退火和延伸等步驟對溫度的精確控制，只用一臺恒溫水浴箱即可完成實驗，所用設備廉價、操作簡單；②LAMP檢測技術針對靶基因設計 4 條引物，再增加2條外引物，可使得其擴增時間縮短到1 h內，極大地提高了擴增效率；③在LAMP 擴增過程中產生大量的焦磷酸根離子，可與SYBR GreenⅠ發生顯色反應[13]，可通過觀察反應體系顏色變化來快速判斷產物的生成。