玉米須抗疲勞口服液衛生學研究

田海蘋，崔 浩,2，李 兵，周鴻立,2*

(1.吉林化工學院 化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022；2.吉林省農業資源綜合開發與利用工程研究中心，吉林 吉林 132000)

目前適合青少年能量、營養、運動的飲品非常多，但適合中老年人以及易疲勞人群的飲料產品比較少[1]，玉米須抗疲勞口服液比碳酸飲料解渴、爽口，比普通的飲料清香淡雅，動物實驗安全性評價認為玉米須對人體不會產生急性、亞慢性毒性危害[2].玉米須成本低廉，價格便宜[3]，具有抗疲勞、抗氧化等功能[4,5]，玉米須抗疲勞口服液在價格上將會占有一定的優勢，適合廣大群眾購買，中老年人糖尿病、中高脂血癥患者越來越多[6]，所以玉米須抗疲勞口服液具有廣闊的市場發展空間.

衛生學研究能夠反映具有抑菌成分的中藥制劑染菌程度及操作者和生產各環節的衛生情況[7].其中微生物限度的檢驗是衛生學中必要的部分[8].金黃色葡萄球菌產生的腸毒素可以引起食物中毒，沙門氏菌可以引起霍亂，根據國家現行標準，食品中不得檢出金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等致病菌[9].

玉米須抗疲勞口服液為預申報保健食品，所以微生物限量操作及限量應符合GB29921-2013中相應類屬食品安全國家標準的規定.玉米須抗疲勞口服液處方中含有的沙棘等有效成分有較強的抑菌活性[10]，為準確檢驗出制劑受污染的情況，分別采用鏡檢、沙門氏菌血清學鑒定進行了微生物限度檢查的驗證[11].本實驗研究為確定口服液的保質期提供重要依據.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

玉米須抗疲勞口服液(玉米須、沙棘、山楂、甘草、甜味劑組成)，吉林黃梔花藥業有限公司中試生產；牛肉粉、月示胨、乳糖、瓊脂，食品級，天津市大茂化學試劑廠；胰蛋白胨，分析純，天津市永大化學試劑有限公司；酵母浸膏，分析純，天津市北方化玻購銷中心；丙酮酸鈉，分析純，煙臺市雙雙化工有限公司；卵黃鹽，分析純，哈爾濱市新春化學試劑廠；沙黃，分析純，哈爾濱市新春化學試劑廠；煌綠，分析純，南京建成生物工程研究所.

JD-CJ-2A型無菌操作臺，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；HX0100135-ZCWS型高壓滅菌鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；FYL-YS-50L型培養箱，鄭州長城科工貿有限公司；HX0100135-ZCWS型全自動微生物生化鑒定系統，天津市泰斯特儀器有限公司.

1.2 實驗過程

需檢樣品共三種如下：(1)玉米須抗疲勞口服液0天，室溫自然環境放置0天；(2)玉米須抗疲勞口服液6個月，在穩定性試驗箱中，按照穩定性試驗中加速試驗的條件，設置溫度40±2 ℃，相對濕度75%±5%放置6個月；(3)玉米須抗疲勞口服液36個月，按照穩定性試驗的長期試驗條件，在室溫(25±2 ℃)，相對濕度60%±10%放置36個月.

在進行微生物限度檢查時，需要對所采用的檢測方法進行驗證試驗[12]；最終根據GB 4789-2016相關規定確定需要對該類屬食品進行金黃色葡萄球菌數及沙門氏菌數測定.

1.2.1 金黃色葡萄球菌檢驗

1.2.1.1 檢驗程序驗檢

根據圖1對金黃色葡萄球菌進行檢驗：

圖1 金黃色葡萄球菌檢驗程序

1.2.1.2 樣品的處理

吸取25 mL玉米須抗疲勞口服液至盛有225 mL 7.5%氯化鈉肉湯的無菌錐形瓶(瓶內可預置適當數量的無菌玻璃珠)中，振蕩混勻.

1.2.1.3 血瓊脂平板

血瓊脂平板見表1.

表1 培養基成分(pH 7.5±0.2)

制法：加熱溶化瓊脂，冷卻至50 ℃，以無菌操作加入脫纖維羊血，搖勻，傾注平板.

1.2.1.4 Baird-Parker瓊脂平板制備

根據GB29921中的方法制作Baird-Parker瓊脂平板[13].

1.2.1.5 初步鑒定方法

金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤、菌落直徑為2～3 mm，顏色呈灰黑色至黑色，有光澤，常有淺色的邊緣，周圍繞以不透明圈(沉淀)，其外常有一清晰帶.當用接種針觸及菌落時具有黃油樣黏稠感.有時可見到不分解脂肪的菌株，除沒有不透明圈和清晰帶外，其他外觀基本相同.從長期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落，其黑色常較典型菌落淺些，且外觀可能較粗糙，質地較干燥.在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色(有時為白色)，菌落周圍可見完全透明溶血圈.挑取上述可疑菌落進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗.

1.2.1.6 確證鑒定

染色鏡檢：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，直徑約為0.5～1 μm.

1.2.2 沙門氏菌的檢驗

沙門氏菌在SS培養基中的菌落形態特征：無色至淡黃色，半透明或不透明，菌落中心有時帶黑褐色.根據《中國藥典》2015年版二部附錄ⅩⅨ O微生物檢驗替代方法驗證指導原則，對沙門氏菌進行考察.

1.2.2.1 檢驗程序

根據圖2對沙門氏菌進行檢驗：

圖2 沙門氏菌檢驗程序

1.2.2.2 樣品的處理

無菌操作稱取25 g/mL樣品，置于盛有225 mL緩沖蛋白胨水(BPW)的無菌錐形瓶內，以8 000～10 000 r/min均質1～2 min，振蕩混勻.調整pH，用1 mol/mL無菌NaOH或HCl調pH至6.8±0.2.無菌操作將樣品轉至500 mL錐形瓶內，于36±1 ℃培養8～18 h.

1.2.2.3 增菌

輕輕搖動培養過的樣品混合物，移取1 mL，轉種于10 mL四氯磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液內，于42±1 ℃培養18～24 h.同時，另取1 mL，轉種于10 mL亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液內，于36±1 ℃培養18～24 h.

1.2.2.4 沙門氏菌培養及確證鑒定

將上述培養物分別劃線于沙門氏菌-志賀氏菌瓊脂培養基(SS瓊脂)的平板上培養18～24 h(必要時延長40～48 h).若平板上無菌落生長，或生長的菌落不同于沙門氏菌的菌落特征，判斷供試品未檢出沙門氏菌.

若平板上生長的菌落與沙門氏菌落特征相似，需要用接種針挑選2～3個菌落分別于三糖鐵瓊脂培養基高層斜面上進行穿刺接種，培養18～24 h，如果斜面未見紅色，底層未見黃色；或斜面為黃色、底層無黑色，判供試品未檢出沙門氏菌.否則進行適宜的生化試驗和血清凝集試驗，確認沙門氏菌.

2 結果與討論

2.1 血瓊脂平板金黃色葡萄球菌檢驗結果報告

血瓊脂平板金黃色葡萄球菌檢驗結果報告見圖3～圖6.

(A：試驗0個月樣品；B：試驗6個月樣品；C：試驗36個月樣品)圖3 血瓊脂平板金黃色葡萄球菌檢驗

圖4 血平板A圖鏡下形態圖5 血平板C圖鏡下形態

(A：試驗0個月樣品；B：試驗6個月樣品；C：試驗36個月樣品)圖6 增菌后的形態

結果：圖3中A、B、C肉眼未看出金黃色葡萄球菌的存在，圖C肉眼可以看出平板上長了大量的菌落；圖4未見金黃色葡萄球菌，但有少量的革蘭氏陽性芽孢桿菌；圖5可明顯的觀察出大量的革蘭氏陽性桿菌；圖6用肉眼可以清晰的看出三者均長出了菌落，觀察其鏡下形態均為革蘭氏陽性桿菌.未檢出金黃色葡萄球菌.

2.2 Baird-Parker瓊脂平板金黃色葡萄球菌檢驗結果報告

結果：圖7中Baird-Parker瓊脂平板的金黃色葡萄球菌檢驗結果報告，三種樣品均未見金黃色葡萄球菌以及其他菌落.

(A：試驗0個月樣品；B：試驗6個月樣品；C：試驗36個月樣品)圖7 Baird-Parker瓊脂平板金黃色葡萄球菌檢驗結果報告

2.3 沙門氏菌-志賀氏菌瓊脂培養基(SS瓊脂)平板沙門氏菌檢驗結果報告

結果：圖8中可以清晰的看出，并未檢出沙門氏菌.

(A：試驗0個月樣品；B：試驗6個月樣品；C：試驗36個月樣品)圖8 SS培養基沙門氏菌檢驗報告

3 結 論

玉米須抗疲勞口服液在血瓊脂平板、Baird-Parker瓊脂平板、SS瓊脂平板的0、6、36個月微生物限度檢查中，均未檢出金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，在血平板的36個月檢驗中，檢驗出了革蘭氏陽性桿菌，但穩定性試驗制定口服液的保質期為20個月，食品安全國家標準中需檢菌為金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，所以玉米須抗疲勞口服液衛生學符合食品安全國家標準.