石墨烯量子點作為熒光探針定量分析糖果中莧菜紅的含量

金 麗,王 影,劉芳同,張棵實，張建坡

(吉林化工學院 化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022)

莧菜紅作為一種合成類有機染料，在中國被作為食品染料添加劑廣泛用于飲料、糖果、碳酸飲料、口香糖、巧克力和其他食品中[1].但是研究結果顯示，過量食用莧菜紅會導致人類生育力顯著下降，并具有致癌、致畸和致突變作用.聯合國糧食及農業組織(FAO)和世界衛生組織(WHO)認為每日平均食用莧菜紅的量不高于0～1.5 mg/kg[2]，而在中國認為每日平均食用莧菜紅的量不高于0～0.5 mg/kg.因而需要建立可靠的用于定量分析莧菜紅含量的方法.高效液相色譜法[3,4]具有分離效率高和分析速度快的優點，但是需要復雜的樣品前處理過程，因而不適用于大批量樣品的分析.分光光度法[5]簡單且可以實現大批量的分析，但是需要進校樣品的預濃縮.電化學方法[6,7]由于具有穩定性好和靈敏度高的特點而被廣泛研究，但是電極的表面處理有一點費時和復雜.其它方法，例如薄層色譜[8]和毛細管電泳[9]，也被用來檢測莧菜紅，但是需要相對比較昂貴的儀器、專門的操作人員和復雜的樣品的前處理等限制了其發展和在實際樣品分析中的應用.直接熒光分光光度法[10]也被用來定量分析莧菜紅，但是需要復雜的樣品前處理過程.因此需要探索其他定量分析莧菜紅的分析方法.

基于納米材料的熒光猝滅與猝滅劑之間良好的線性關系，熒光猝滅定量分析方法受到廣泛關注[11，12].其中石墨烯量子點作為一種炭材料，具有穩定性好、水溶性好、毒性低、生物相容性好和不易光漂白等特點，近年來被廣泛用于熒光傳感器的研究[13-17].而且據我所知，目前還未見基于石墨烯量子點熒光猝滅定量分析莧菜紅含量的報道.

本文作為熒光探針石墨烯量子點被成功地用于莧菜紅的定量分析.此方法具有簡單、快速和成本低的特點，對保障食品安全和消費者權益具有重要意義.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

莧菜紅、檸檬酸、蔗糖、葡萄糖、檸檬酸鈉和牛血清白蛋白均購自國藥集團化學試劑有限公司.透析袋(保留分子1000 Da)購自生工生物工程技術服務有限公司.所有的試劑均為分析純，使用前未做任何處理.

采用天津港東F-280熒光分光光度計測得熒光光譜、采用島津UV-2550紫外可見分光光度計測得紫外吸收光譜、熒光照片采用Nikon D7000獲得，通過拉曼檢測系統獲得拉曼光譜，包括一個He-Ne光源(20 mW，633 nm，UNIPHASE)，一系列拉曼光譜濾光片(Semrock)和一個分光光度計(IHR 320，JY，法國).

1.2 實驗過程

1.2.1 石墨烯量子點的制備

根據文獻報道的方法制備了石墨烯量子點[18,19].簡述為，將2 g的檸檬酸加入到50 mL的燒杯中，200 ℃加熱15 min，直至檸檬酸變為亮黃色.之后加入30 mL的10 mg/mL NaOH溶液，超聲1 min，得到黃綠色的石墨烯量子點.用NaOH溶液調節pH=7.0，透析過夜后，旋轉蒸發去除大部分的水，80 ℃烘干2 h，得到淺黃色晶體，備用.

1.2.2 石墨烯量子點用于定量分析莧菜紅

將10 μL莧菜紅樣品加入到0.1 mL石墨烯量子點中，定容至2 mL(調節pH=5，石墨烯量子點的濃度為0.1 mg/mL)，室溫下孵育5 min后測熒光光譜,激發波長為367 nm，激發和發射狹縫為5.0 nm.

2 結果與討論

2.1 石墨烯量子點的表征

首先對石墨烯量子點進校了表征.如圖1b所示，石墨烯量子點的熒光發射光譜為457 nm，激發波長為367 nm；圖1b插入圖可見，所合成的石墨烯量子點在365 nm的紫外光激發下具有明亮的藍色，而在自然光下為黃綠色.同時采用室溫拉曼光譜對產物進行了表征(如圖1b所示)，可見兩個D(～1 408 cm-1)和G(～1 640 cm-1)兩個特征峰.結果說明成功地制備了石墨烯量子點.

Wavelength/nma

Raman Spectra/cm-1b

2.2 石墨烯量子點和莧菜紅之間的相互作用及其反應機理

如圖2所示，當將莧菜紅加到石墨烯量子點溶液中時可以引起石墨烯量子點明顯的降低，7.75 mg/L的莧菜紅溶液可以引起石墨烯量子點83.28%的猝滅率.其反應機理與之前文獻闡述的內容相似[20].莧菜紅作為一種有機染料，每一個分子均具有-SO3-和-OH基團，而石墨烯量子點表面具有羧基和羥基，羥基和磺酸基之間具有較強的相互作用，因而可以形成石墨烯量子點/莧菜紅復合物.這可以通過紫外吸收光譜加以證明，如圖3所示，隨著咸菜紅濃度的增加，石墨烯量子點的紫外吸收峰(334 nm)會發生明顯的藍移，說明石墨烯量子點和莧菜紅之間形成復合物.

Wavelength/nm圖2 加入不同濃度莧菜紅后石墨烯量子點的紫外吸收光譜

采用變溫實驗進一步討論了反應機理，采用方程F0/F=KLBb[C]+b對數據進行了處理，其中F0代表石墨烯量子點的熒光強度，F代表加入莧菜紅后石墨烯量子點的熒光強度，C代表莧菜紅的濃度.如圖3所示，隨著孵育溫度的增加，擬合直線的斜率依次減小，這是因為隨著溫度增加，所形成的石墨烯量子點/莧菜紅復合物的穩定性依次減弱.

此外，Kq代表熒光猝滅常數，可以通過方程Kq=KLB/τ0計算，τ0代表熒光材料的平均熒光壽命(τ0=6.14 ns).可知Kq為1.8×1012mol·L-1·s-1，該數值遠遠大于2×1010mol·L-1·s-1(最大動力學猝滅常數)[21].結合紫外吸收光譜可以判定莧菜紅所引起石墨烯量子點熒光強度的降低為靜態猝滅過程.

concentration(mmol·L-1)圖3 不同溫度下莧菜紅濃度和石墨烯量子點熒光變化(F0/F)之間的關系圖

2.3 實驗條件的優化和檢出限的確定

研究了pH和孵育時間對反應體系的影響.如圖4a所示，反應體系的熒光強度變化(F0/F)會隨著pH值的增加而先增大后減小，因而選擇pH等于5；如圖4b所示，當孵育5 min后，該體系的熒光強度變化(F0/F)趨于平穩，因而選擇孵育時間為5 min.

pHa

Time/minb圖4 pH和孵育時間對石墨烯量子點熒光強度變化(F0/F)的影響

在最優條件下，發現莧菜紅濃度為0.5～3.0 μg/L的范圍內，石墨烯量子點熒光強度的降低(F0/F)與莧菜紅濃度之間具有良好的線性關系(如圖5所示)，回歸方程為F0/F=0.50[莧菜紅]+0.94，相關系數為0.998.通過方程LOD=(3.3σ/k)計算了檢出限(LOD)，σ代表標準偏差，k代表回歸方程的斜率，可知最低檢出限為0.25 μg/L(0.4 nmol/L).通過5次重復檢測1.5 μg/L的莧菜紅，得到相對標準偏差(2.8%)，說明該方法具有良好的重復性.

Concentrationg of amaranth(μg/L)圖5 莧菜紅濃度對石墨烯量子點熒光強度的影響關系圖(石墨烯量子點濃度為0.05 mg·L-1，激發波長為367 nm)

2.4 干擾實驗和實際樣品的檢測

為了將該熒光猝滅法用于糖果中莧菜紅含量的測定分析，首先考察了糖果中可能共存物質(葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、檸檬酸鈉和BSA)和金屬離子(K+和Na+)對該反應體系的影響.如圖6所示，所有物質均未引起熒光強度明顯的變化，說明該熒光猝滅方法具有良好的選擇性.

Interfering substances圖6 最優條件下不同物質對該猝滅體系的影響

表1 回收率實驗

將該熒光猝滅方法應用于定量分析糖果中莧菜紅的含量.檢測前，將1 g糖果溶解于10 mL水中，之后用磷酸緩沖溶液定容至100 mL(pH=5).采用標準加入法測定樣品中莧菜紅的含量，如表1所示.通過分析可知，糖果樣品中莧菜紅的含量為0.010 67 g/kg，回收率為98.6%～100.3%，說明該熒光猝滅方法可以用于莧菜紅含量的定量分析.

3 結 論

本文建立了一種基于石墨烯量子點熒光猝滅定量分析莧菜紅含量的方法.莧菜紅的濃度與石墨烯量子點熒光強度的降低之間具有良好的線性關系，最低檢出限為0.25 μg/L(0.4 nmol/L).通過紫外吸收光譜、變溫實驗和相關計算對猝滅機理進行了討論，結果表明此莧菜紅所引起的石墨烯量子點熒光強度的降低為靜態猝滅過程.此外，將該方法用于定量分析糖果中莧菜紅的含量，取得了比較滿意的結果.與之前檢測莧菜紅含量的方法相比，該方法簡單、快速、成本低，是一種快速分析溶液中莧菜紅含量的分析方法.