陰離子交換高效液相色譜法測定嬰幼兒食品與乳品中的核苷酸

肖偉敏，劉文麗，張協光，蘇佳婷，楊國武

(深圳市計量質量檢測研究院，廣東 深圳 518109)

核苷酸是一類由嘌呤堿或嘧啶堿、核糖或脫氧核糖以及磷酸組成的化合物，參與核酸構成，對嬰幼兒生長發育有重要的營養作用，其在母乳中含量豐富，但在牛乳中的含量較低[1-2]，因此，核苷酸作為重要的營養強化劑被廣泛用于嬰幼兒食品和乳品中。在我國，根據《食品營養強化劑使用標準》GB14880-2012的規定，嬰幼兒配方食品中作為添加劑的核苷酸主要有胞嘧啶核苷酸(CMP)、腺嘌呤核苷酸(AMP)、尿嘧啶核苷酸(UMP)、鳥嘌呤核苷酸(GMP)、次黃嘌呤核苷酸(IMP)，添加量為0.12～0.58 g/kg(以核苷酸總量計)[3]。

嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的常見檢測方法有反相高效液相色譜法、離子色譜法、液相色譜-質譜聯用法等[4-12]，其中高效液相色譜法的應用最為廣泛。我國于2016年8月31日頒布了高效液相色譜測定嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的方法標準——《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的測定》GB 5413.40-2016(以下簡稱GB 5413.40)[13]。《國家食品安全監督抽檢實施細則(2017年版)》規定，2017年3月1日起核苷酸在我國開始作為嬰幼兒配方食品的抽檢項目。但實際檢測中發現，以GB 5413.40“5.2參考色譜條件”測定時，由于核苷酸物質的極性較大，用C18-T反相色譜柱分析時，流動相中即使加入離子對試劑四丁基硫酸氫銨，CMP在反相色譜柱上的保留依然較弱，出峰時間早，以致對實際樣品中的CMP進行定量時有基質干擾(見圖1)，從而給監督檢驗工作帶來了困難。

勵炯等[8]以固相萃取凈化，使用氨基柱測定核苷酸；鄭紅等[5]使用強陰離子固相萃取柱凈化樣品，再用反相色譜柱分離核苷酸。兩種方法均對GB 5413.40的樣品前處理和色譜條件進行了優化。但在依據GB 5413.40開展監督檢驗時，樣品前處理條件須按國標指定的要求，僅標準中的“參考色譜條件”允許優化。因此，為依據GB 5413.40準確開展嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的監督檢驗工作，本研究結合核苷酸在陰離子交換方面的保留和分離優勢，首次將陰離子交換色譜柱應用于嬰幼兒食品和乳品中5種核苷酸的測定，建立了準確簡便的陰離子交換高效液相色譜測定嬰幼兒食品和乳品中核苷酸含量的方法，可為嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的含量檢測及國家產品質量監督提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀(安捷倫公司)，配二極管陣列檢測器；分析天平(感量為0.1 mg)。

核苷酸標準品CMP、AMP、UMP購自百靈威公司，GMP、IMP購自安譜公司，標準品純度均大于98%；磷酸二氫鉀(分析純)、甲醇(色譜純)直接使用；奶粉質控樣品SRM1849a(簡稱1849a)購自美國國家標準與技術研究院(National Institute of Standards and Technology，NIST)；嬰幼兒配方食品來源于深圳市各大市場和超市。實驗用水為Milli-Q去離子水(美國Millipore公司Milli-Q超純水機制備)。

1.2 標準溶液的配制

用水配制質量濃度均為1.00 g/L的CMP、AMP、UMP、GMP、IMP標準儲備液，于4 ℃保存。然后配制5種核苷酸質量濃度分別為0.200、1.00、10.0、50.0、100、200 mg/L的系列標準工作液，用于線性關系考察。

1.3 樣品前處理

樣品前處理按GB 5413.40中的“5.1試樣制備”進行。

1.3.1樣品預處理含淀粉的試樣：稱取混合均勻的固體試樣5 g(精確至0.1 mg)于100 mL錐形瓶中，加入約0.2 g淀粉酶，用20 mL熱水(30～40 ℃)充分溶解，或稱取混合均勻的液體試樣約20 g(精確至1 mg)于100 mL錐形瓶中，加入約0.2 g淀粉酶搖勻，于(37±2) ℃培養箱內酶解30 min。取出冷卻至室溫。

不含淀粉的試樣：取混合均勻的固體試樣5 g(精確至0.1 mg)于100 mL錐形瓶中，加入20 mL熱水(50～60 ℃)充分溶解，冷卻至室溫，或稱取混合均勻的液體試樣約20 g(精確至1 mg)于100 mL錐形瓶中。

1.3.2待測液的制備用醋酸將試樣溶液調至pH 4.1，移入50 mL容量瓶中，用水定容，濾紙過濾，所得濾液用0.45 μm微膜過濾，備用。

1.4 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax SAX(4.6 mm×250 mm，5 μm)強陰離子交換色譜柱，流動相：A為甲醇、B為磷酸二氫鉀水溶液(10 mmol/L，pH 4.5)；梯度洗脫：0～25.0 min，40%～100%B；25.0～25.1 min，100%～40%B；流速1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：254 nm；進樣體積10 μL。

圖1 采用C18-T色譜柱分離核苷酸的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of nucleotides by C18-T column A：mixed standard solution；B：real sample

圖2 采用SAX色譜柱分離核苷酸的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of nucleotides by SAX columnA：mixed standard solution；B：real sample；separation condition：“1.4”

2 結果與討論

2.1 色譜柱的選擇

考察了GB 5413.40推薦的C18-T色譜柱(SupelcosilTMLC-18-T，250 mm×4.6 mm，5 μm),以及Phenomenex Kinetex PFP(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent Zorbax NH2(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Agilent Zorbax SAX(4.6 mm×250 mm，5 μm)等其它類型的色譜柱對核苷酸的分離效果。結果表明，C18-T和SAX色譜柱對5種核苷酸標準品的分離較好。但在實際樣品分析時，由于CMP在C18-T反相色譜柱上的保留較弱，出峰較早，定量時有基質干擾(見圖1)。因此，本研究最終采用SAX色譜柱進行分離分析。

盡管離子色譜法是分析陰、陽離子的高效分離測試技術[14]，且核苷酸在水溶液中呈離子狀態，可應用離子色譜的作用原理進行分離。但實際工作中離子色譜儀的應用不如高效液相色譜儀廣泛，故本文選用離子色譜原理進行分離的離子交換色譜柱。Zorbax SAX色譜柱因硅膠上鍵合了季銨強陰離子交換基團，故具有離子交換作用和反相吸附作用。本研究結果表明，陰離子交換高效液相色譜法分離核苷酸時，各待測物在實驗條件下均有較好的保留，可實現基線分離，且標液和樣品檢測時5種核苷酸均無干擾，定量準確(見圖2)。

2.2 流動相條件的優化

離子交換色譜的流動相需要合適的緩沖溶液，本實驗選擇離子交換色譜法的常用淋洗劑——KH2PO4水溶液作為流動相。由于核苷酸在強酸性及堿性條件下不穩定，在pH值較低的強酸性條件下，核苷酸的解離被抑制；而pH值升高至弱酸性條件時，核苷酸解離為陰離子，與SAX固定相作用力增強，保留增加。通過對pH值(pH 3.0、4.5)的優化比較，選擇分離和峰形較好的10 mmol/L KH2PO4(pH 4.5)水溶液作為緩沖溶液。

在離子交換色譜中存在3種電離平衡，分別為樣品組分的電離平衡、流動相中緩沖溶液的電離平衡、柱上離子交換基團的電離平衡。色譜柱保留行為的變化、流動相組成會綜合影響上述電離平衡[15]。因此，在流動相條件優化時，設計了緩沖液梯度增加(見“1.4”)和緩沖液梯度減少(0～23.0 min，100%～35%B；23.0～23.1 min，35%～100%B)兩種方式，流速均為1 mL/min。實驗表明，兩種梯度變化方式下，5種核苷酸均可實現基線分離。在不同的洗脫條件下，各組分之間的出峰順序和分離度發生了改變，實驗通過標準物質對各分析物進行定性。由于緩沖液梯度增加(見“1.4”)方式的分離度更好，保留時間更穩定，色譜柱的使用壽命更長，因此確定為色譜條件。

2.3 線性范圍、檢出限與定量下限

將核苷酸系列標準工作液按優化條件進樣，以標準系列溶液的質量濃度為橫坐標(x，mg/L)，相應的峰面積為縱坐標(y)做線性回歸方程；分別以信噪比(S/N)為3和10計算檢出限和定量下限，結果見表1。5種核苷酸的線性相關性較好，相關系數(r)為0.999 8～1.000 0，線性范圍均為0.200～200 mg/L。而且，本改良方法較GB 5413.40的定量下限(CMP、AMP、UMP、GMP、IMP的定量下限分別為3.3、5.0、5.0、5.0、6.7 mg/kg)更低。

表1 5種核苷酸的線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限與定量下限Table 1 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients(r)，LODs and LOQs of five nucleotides

2.4 回收率與相對標準偏差

取空白嬰幼兒配方奶粉5 g，分別添加低、中、高3個水平的混合標準工作液，每個加標水平做6個平行樣品，回收率及相對標準偏差見表2。結果表明，本方法的回收率為95.5%～108%，相對標準偏差(RSD)為1.0%～3.2%，準確度和精密度符合GB/T 27404-2008 F.1和F.3的要求[16]。

表2 5種核苷酸的加標回收率與相對標準偏差(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of five nucleotides spiked in samples(n=6)

2.5 實際樣品分析

本研究在2017年完成了深圳市100多批次嬰幼兒配方食品中核苷酸的測定，包含雅培、美贊臣、美素佳兒、惠氏、愛他美、諾貝能、太子樂、合生元等品牌。同時，測定了有證質控樣品1849a。實驗結果表明，1849a質控樣品中的5種核苷酸含量均在參考值范圍內，實際奶粉樣品的檢測均無基質干擾，部分樣品的檢測結果見表3。

表3 1849a質控奶粉和10個嬰幼兒配方奶粉中核苷酸的含量

Table 3 Contents of nucleotides in 1849a quality control milk powder and 10 infant formula milk powder (mg/100g)

*no detected

3 結 論

本研究建立了陰離子交換高效液相色譜測定嬰幼兒食品和乳品中核苷酸含量的方法。該方法樣品前處理依據GB 5413.40，處理過程簡單；在高效液相色譜分離階段，陰離子交換色譜柱對核苷酸類物質有較強的保留，5種核苷酸分離度好，檢出限低，定量準確度高。該改良方法很好地解決了高效液相色譜法測定嬰幼兒食品和乳品中核苷酸含量時易被雜質干擾的問題，完善了GB 5413.40的參考色譜條件，可為嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的監督監管工作提供技術支持。