紫草油對肛瘺術后組織修復中Smad3表達的影響

趙誠 王未娟 張瓊

作者單位：福建中醫藥大學附屬人民醫院肛腸科，福建 福州 350004

紫草油在我院多年應用于肛腸病術后的治療，在創面愈合方面效果明顯，但作用機制不明。Smad蛋白家族是細胞內重要的信號轉導蛋白，參與包括細胞增殖、凋亡、遷移、分化等功能。本研究以Smad3因子作為研究對象，從分子生物水平初步闡明Smad3因子表達變化與創面愈合過程中的關系。

1 資料與方法

1.1 診斷標準

按照《肛瘺臨床診治指南（2006版）》[1]制定的標準選取低位單純性肛瘺作為研究對象。

1.2 病例資料

本研究課題入選的150例肛瘺患者均為福建中醫藥大學附屬人民醫院肛腸二科2017年3月—2018年3月住院患者。利用簡單隨機方法將患者分成紫草油組、凡士林組、膚痔清組三組，每組各50例。

1.3 治療方法及實驗方法

1.3.1 肛瘺切開術 所有病例均在局麻下行“肛瘺切開術”，各組手術當天靜滴止血藥，手術當天及術后第1 d、第2 d靜滴抗生素抗感染。各組患者每日便后溫水坐浴，分別予紫草油、凡士林組、膚痔清外用，均勻涂在創面上，厚約1 mm。分別于術后第7、14天留取血清，并記錄各組創面愈合時間。

1.3.2 血清提取 各實驗組于手術后第7、14天后抽取外周靜脈血3～5 ml，離心后利用微量移液器吸取分離上層血清至1.5 ml EP管，置-70℃凍存待測。

1.3.3 RT-PCR法 用RNA提取試劑提取樣本中總RNA。總RNA濃度和純度用使用Nanodrop2000超微量分光光度計測定，之后RT-PCR進行按兩步法。目的基因引物∶ Smad3基因的上游引物序列為5’-GAAATCAGTTCTGGGCTATA-3’，下游引物序列為5’-CTCCAGTATTTGTCCTCTAC-3’（擴增產物長度：100 bP）。內參β-actin序列為：上游5’-ACTCTGTGTGGATTGGTGGC-3’，下游為5’-GAAAGGGTGTAAAACGCAGC-3’（擴增產物長度：155 bP）。PCR反應條件為：擴增程序為：95°30 s，（95℃ 5 s，60℃ 34 s）×40個循環。各樣品的目的基因和內參基因分別進行Real-Time-PCR反應。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。

1.3.4 Western-blot法 用細胞裂解液提取總蛋白，考馬斯亮藍法測定各細胞樣本蛋白含量，取等量總蛋白用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后進行轉膜。將封閉后的膜直接放入一抗工作液中，4℃反應過夜。緊接著放入二抗工作液中作用60分鐘。最后曝光及洗片，用image J軟件分析灰度值。

1.4 統計學方法

用SPSS 20.0統計軟件進行分析處理，計量資料采用（）表示，兩樣本之間采用t檢驗，分析多樣本比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 紫草油治療肛瘺術后Smad3 mRNA表達情況

研究結果如表1顯示，經治療，術后第14 d紫草油組中的Smad3 mRNA表達低于凡士林組、膚痔清膏組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；說明紫草油能提高降低Smad3 mRNA表達水平，進而促進創面生長，縮短愈合時間。

2.2 紫草油治療肛瘺術后Smad3蛋白表達情況

Western blotting分析結果顯示，凡士林組、膚痔清組、紫草油組治療肛瘺術后Smad3蛋白表達逐漸下降。術后第14 d紫草油組Smad3蛋白的表達水平低于其他兩組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。提示中藥紫草油能有效下調血清Smad3含量，進而促進創面愈合。詳見圖1、表2。

3 討論

肛瘺是指肛管或直腸因病理原因與肛周相通的一種異常管道，亦稱為肛管直腸瘺[2]。《五十二病方》記載了“巢塞直者，殺狗，取其脬，以穿螽，入直中，炊之，引出，徐以刀去其巢”，這里的“巢者”就是指現代的“肛門瘺管”，肛瘺牽拉切開術由此發展而來[3]。現代醫學提倡精準治療，肛瘺的治療出現了損傷更小的隧道式手術方式。但由于病變部位的特殊性，一般創面較大且結構較復雜。加之術后患者排便、換藥的痛苦大，恢復時間長[4]。此外傳統改良術式有治愈率高的優點，但一直存在術后疼痛明顯、愈合時間長的問題。近年來各類生物材質逐步應用于肛瘺的治療術式中[5]，極大地保護了肛門括約肌的功能。現代生物學技術克服了傳統改良術式的缺點，但治愈率不高，且價格昂貴，所以針對肛瘺的治療，在治愈率、術后疼痛、經濟負擔三者之間找到平衡點也是肛腸科需探討努力解決的問題。

表1 三組患者術后第7、14 d Smad3 mRNA表達情況 （）

注：三組第14 d比較，*P＜0.05

組別 例數 時間 Smad3（ng/L）紫草油組 50 第7 d 0.603±0.015第 14 d 0.438±0.043*膚痔清組 50 第7 d 0.821±0.019第 14 d 0.704±0.014*凡士林組 50 第7 d 1.008±0.015第 14 d 1.036±0.036

表2 三組患者術后第7、14 d Smad3蛋白相對表達情況 （）

表2 三組患者術后第7、14 d Smad3蛋白相對表達情況 （）

注：3組第14天比較，*P＜0.05

組別 例數 時間 Smad3（ng/L）紫草油組 50 第7 d 0.312±0.021第 14 d 0.253±0.047膚痔清組 50 第7 d 0.522±0.046第 14 d 0.508±0.044*凡士林組 50 第7 d 0.754±0.021第 14 d 0.771±0.036

中醫藥在肛瘺術后創面修復方面有著豐富的臨床實踐經驗和良好的療效[6]。紫草油組方中紫草為君藥，黃連為佐藥。紫草為紫草科植物紫的根。味苦、甘，性寒。入心、肝經。主要功效：活血、涼血、透疹解毒。多用于皮膚潰后，或用于各類慢性潰瘍，可收清熱消腫、減少滲出，從而可生肌長肉，促進潰瘍愈合，特別是創面赤腫及滲出較多者。黃連性寒，味苦，有清熱、燥濕、瀉火解毒的功效。二味共為君藥共奏清熱利濕、消腫止痛之功。運用清熱利濕化瘀法于肛瘺術后，體現中醫外治的優勢在臨床的應用。

傷口創面的修復過程包括四個步驟：即傷口周圍炎癥反應、血管再生及肉芽組織的生長、結締組織和上皮細胞的修復、組織重構以致傷口愈合[7]。Smad作為細胞內重要的信號轉導蛋白，可以直接參與TGF-β超家族成員以及骨形態發生蛋白等多個成員的信號傳導。Smad蛋白根據功能不同分為受體激活性Smads、共同介導性Smads及抑制性Smads。真正反映TGF-β1/Smad3信號傳導通路的激活水平的是活化的smad3表達水平[8-9]。Smad3蛋白能與Smad4形成復合物，促進創面修復相關靶基因的表達[10]。研究表明激活 TGF-β1/Smad3信號通路，增加膠原蛋白的合成，可加速創面的修復[11]。因此Smad3及其產物可以調節創面愈合。過表達Smad3的成纖維細胞合成膠原能力增加，而敲除Smad3后，創傷愈合加速[12]。本實驗研究中表明：3組藥物干預后Smad3表達逐漸下降。術后第14天紫草油組中的Smad3 mRNA及蛋白表達低于凡士林組、膚痔清膏組，差異有統計學意義（P＜0.05）。說明紫草油能夠干預Smad3因子的表達水平，有效促進創面的愈合。

本實驗研究說明紫草油能促進肛瘺術后創面的愈合及縮短愈合時間，可能通過調節Smad3 因子表達水平。因此如何有針對性的、科學的調控Smad3因子表達，也是進一步研究難點。