四環素耐藥糞腸球菌生物膜的分析

魏影 郭妍 柏柳 陳艷麗 黃嶸赫 余治健 鄧啟文 李桂秋

作者單位：1 黑龍江省醫療服務管理評價中心考核準入科，黑龍江 哈爾濱 150081；2 深圳市南山區人民醫院中心實驗室，廣東深圳 518052

糞腸球菌感染大多數為內源性感染，能通過機體腸上皮細胞而易位，接著感染淋巴結，然后再擴散到機體的其他細胞組織，在醫院內可引起人體多系統感染：泌尿系感染、皮膚軟組織感染、呼吸道感染等，還能引起危及生命的心內膜炎、腹腔感染、敗血癥等[1-4]。生物膜形成是糞腸球菌的重要特點。近年研究表明四環素耐藥糞腸球菌已經成為較高的比例，文獻報道我國糞腸球菌四環素耐藥率波動60%左右。細菌對四環素產生耐藥主要是獲得了四環素耐藥基因，并且這些基因常與可移動成分如可傳遞性質粒、轉座子、接合轉座子和整合子接合導致其在菌群間廣泛傳播。然而四環素耐藥糞腸球菌的耐藥基因特點和生物膜形成之間關系鮮見報道。多個毒性因素與糞腸球菌生物膜的形成有關，糞腸腸球菌的毒力因子有聚類物質、表面蛋白、細胞溶解素、明膠酶E、透明質酸酶、信息素誘導蛋白、膠原結合蛋白、心內膜炎抗原及信息素等。四環素耐藥糞腸球菌中這些毒力因子的分布尚不清楚。因此，本實驗主要探討四環素耐藥糞腸球菌生物膜形成特點及與毒力基因、耐藥基因分布之間的關系，分析該類細菌生物膜形成特點。

1 材料和方法

1.1 材料

251株自深圳市南山醫院2010年1月—2017年6月分離自患者標本的糞腸球菌，質控菌株是糞腸球菌菌株ATCC29212和OG1RF （ATCC47077）。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定和藥敏試驗 采用BD Phoenix-100全自動細菌鑒定/藥敏系統進行藥敏試驗，主要藥物包括氨芐西林和萬古霉素。采用2017年版美國臨床和實驗標準化協會（CLSI）推薦的微量肉湯稀釋法再次確認四環素藥敏結果，以糞腸球菌ATCC29212作為質控菌株。四環素敏感、中介和耐藥判斷標準為MIC≤4 mg/L、MIC=8 mg/L和MIC≥16 mg/L。

1.2.2 毒力基因的檢測 毒力基因esp、gelE、Asa1、cylA、hyl引物由北京六合華大基因公司合成[5-6]。按試劑盒說明提取菌株基因組DNA，-20℃保存備用。采用PCR檢測毒力基因。PCR體系（50 μl）：Dream Taq Green PCR Master Mix（2×） 25 μl，上、下游引物各 1 μl，DNA2 μl， 加 dd H2O 補至 50 μl。PCR 反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環；72℃ 10 min，PCR產物于4℃保存。PCR反應產物均用1%的瓊脂糖凝膠電泳，根據有無陽性擴增產物及目的基因片段長度進行判斷分析。

1.2.3 生物膜檢測及判讀 根據參考方法，對生物膜的形成進行了檢測。對在TSB培養基中過夜生長的細菌；稀釋200與TSBG培養基中，其中有0.5%的葡萄糖；每孔200 μl加樣到96孔聚苯乙烯微板上，每個菌株3個復孔；37℃的情況下靜態孵化24小時；吸干孔子菌液并用PBS清洗3次，用甲醇固定15分鐘后吸干，用0.5%的結晶紫染色10分鐘后吸干，再用蒸餾水沖洗；最后加入4∶ 1無水乙醇和丙酮的匯合溶液，混合均勻后在OD570光度下檢測。每一項試驗至少進行3次。生物膜OD值的判讀在染色后的96個微孔讀數從0.05～3.50。生物膜表型分類基于他人的方法，強陽性（OD 570＞2），中等（OD 570，1～2），或弱（OD 570＞0.5和OD 570＜1）。

1.3 統計學分析方法

采用Execl表格建立數據庫，統計入組菌株各項指標結果，采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析。用t檢驗進行連續性變量的單因素分析，采用χ2檢驗或Fisher’s確切概率法分析分裂變量。所有檢驗都是雙側的，當P＜0.05時，認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 四環素耐藥糞腸球菌生物膜的形成特點

在結晶紫染色后的96孔板讀數從0.04～3.50。生物膜表型分類基于他人的方法分為（OD570＞2），中等（OD570，1～2），或弱（OD570＞0.5和＜1.0）[7-9]。OG1RF控制菌株（弱生物膜）和ATCC29212菌株OD570的中值分別為0.95和0.22。在所有被檢測的糞腸球菌分離菌株中，有超過一半的糞腸生物膜表現為弱陽性及以上，在這些生物膜形成的菌株中，弱生物膜表型、中等生物膜表型和強生物膜表型中菌株數相差不大。利用肉湯稀釋法測定了四環素的MIC值，并對MIC16 μg/ml的抗性標準進行了分類，發現199株含有四環素抗性的菌株，沒有萬古霉素耐藥株。四環素敏感、中介和耐藥的糞腸球菌生物膜形成的流行率為50.0%（17/34）、55.6%（10/18）和59.3%（118/199），見表1。生物膜的形成比率有逐步升高的趨勢，值得注意的是強生物形成比例在四環素耐藥和中介菌株中高于四環素敏感組（19.6% vs.16.7%vs.8.8%），中介組和耐藥組強生物膜形成比例差別沒有統計學意義。這些糞腸球菌沒有氨芐西林和萬古霉素耐藥株。

2.2 四環素耐藥糞腸球菌生物膜形成與四環素耐藥基因之間的聯系

PCR檢測結果提示四環素耐藥糞腸球菌的耐藥基因tetM和tetL陽性檢出率分別為87.9%（175/199）和25.6%（51/199）；沒有檢測到一株tetS基因陽性株，tetM和tetL耐藥基因與生物膜形成之間關系仍有待進一步研究。tetM和tetL基因與生物膜形成經統計學分析無相關性（P＞0.05），見表2。

2.3 生物膜形成與毒力基因間的相關性

199株糞腸球菌四環素耐藥的菌株，對PCR擴增毒性基因的分析表明，esp、asal和cylA陽性糞腸球菌分離菌株比其相對應的陰性分離株的生物膜形成率提高，其與生物膜形成經統計學分析有相關性（P＜0.05）；而hyl基因與其結果正好相反，但其與生物膜形成經統計學分析也有相關性（P＜0.05）；此外，生物膜的形成與gelE毒力基因無相關性（P＞0.05）（見表3）。

3 結論

本研究結果提示四環素耐藥糞腸球菌的生物膜陽性率（59.3%）與四環素中介組和四環素敏感組差異沒有統計學意義，可能與四環素敏感菌株組合中間組入組例數太少有關，四環素不耐藥組的糞腸球菌生物膜形成比例有待進一步研究。總體而言，四環素耐藥糞腸球菌生物膜陽性與糞腸球菌整體陽性率相比并沒有偏高，但是四環素耐藥組和中介組中強陽性的菌株比例高于敏感組是需要引起注意。糞腸球菌生物膜形成和抗生素耐藥關系的研究報道較多。本研究四環素耐藥組中無萬古霉素和氨芐西林耐藥株，因此對于四環素耐藥菌株中這些多重耐藥菌株的生物膜特點仍有待進一步研究。四環素耐藥基因的檢測中發現，糞腸球菌主要攜帶tetM基因，tetM、tetL和tetS基因與生物膜的形成沒有相關性。我們的整體結果提示在四環素耐藥糞腸球菌中抗生素的敏感性與生物膜的形成無相關性，四環素耐藥基因tetM、tetL和tetS與生物膜形成無相關性。

表1 生物膜形成能力和四環素敏感性之間的關系（n，%）

表2 四環素耐藥基因和生物膜形成之間的關系（n，%）

表3 四環素耐藥糞腸球菌中生物膜形成能力與毒力基因之間關系

本研究發現四環素耐藥糞腸球菌中esp+分離株更有可能表現出強或中等的生物膜形成，這與之前的幾項研究一致，這些研究表明該毒力基因和糞腸球菌生物膜形成之間聯系[5-6，10-13]。本研究提示gelE基因與糞腸球菌強陽性生物膜形成成反比；這與先前的研究結果中gelE可能有利于糞腸球菌生物膜的發展不一樣，但也有另一些研究則發現，在糞腸球菌中，gelE的存在與生物膜的形成沒有相關性[3]。此為本實驗中還發現四環素耐藥糞腸球菌中asal 、hyl和cylA與糞腸球菌生物膜的形成有相關性；此前有報道稱，cylA與尿道分離的糞腸球菌生物膜形成有關[4]。因此四環素耐藥糞腸球菌中esp、asal、hyl和cylA等毒力基因與生物膜形成密切相關。

總之，目前的研究表明四環素耐藥糞腸球菌容易形成生物膜，生物膜形成陽性率與四環素中介菌株比較無差別。四環素耐藥糞腸球菌中抗生素的敏感性與生物膜的形成無相關性，四環素耐藥糞腸球菌生物膜形成能力與四環素耐藥基因tetM、tetL和tetS基因無相關性。esp、asal、hyl和cylA與四環素耐藥糞腸球菌生物膜形成顯著性相關。