再障兒骨髓間充質干細胞體外造血支持作用的研究

朱巖，鐘佳偉

（蘭州市安寧區萬里醫院 兒科，甘肅 蘭州 730070）

0 引言

再生障礙性貧血是因機體造血增生不良以及外周血全血細胞減少而引起的出血、反復感染、貧血為主要臨床特征的一組綜合征，該病由某種或多種復合因素引起，屬骨髓造血功能衰竭性疾病。為了進一步了解再障兒骨髓間充干細胞造血支持作用，本研究以近年收治的該類患兒為研究對象，通過實驗觀察患兒骨髓間充質干細胞的造血作用，為臨床治療提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取我院2010年至2015年收治的再生障礙性貧血患兒17例進行研究，符合再生障礙性貧血診斷標準并經實驗室檢查確診[3]，男8例，女9例；年齡3-12歲，平均（4.9±1.3）歲。所有患兒確診并經監護人同意后，從患兒髂前或髂后上棘抽取其骨髓標本，并進行網織紅細胞、血常規、流式細胞學、骨髓涂片、骨髓活檢等。另選取5例健康成人作為對照組，男3例，女2例，均抽取其骨髓標本。

1.2 方法

（1）骨髓標本的采集。研究組患者髂前或髂后上棘穿刺抽取5 mL骨髓液；對照組骨髓標本來源于健康成人肋骨處骨髓液。

（2）分離培養間充質干細胞。①將骨髓標本進行稀釋，采用1.077 g/mL Ficoll-Paque分離液離心分離單個核細胞；②將單個核細胞接種于培養瓶中，培養體系為低糖DMEM培養液（由加拿大wisent公司生產，貨號：sc-224478）（內含10%胎牛血清），細胞濃度維持在1×106mL；③培養瓶放入培養箱培養48h，更換培養液，并觀察細胞貼壁情況，去除未貼壁細胞；④每3-5 d更換一半培養液,細胞生長融合＞80%成片存在時以0.25%胰酶消化，傳代至第3-6代的細胞待用[1]。

（3）觀察間充質干細胞生物學特性。將（2）的間充質干細胞接種于24孔培養板至細胞長滿80%消化傳代，記錄每次傳代的細胞數量及形態；收集第3代間充質干細胞并測定其細胞表型。

（4）間充質干細胞對臍血淋巴細胞轉化的影響。①臍血取自健康新生兒，12 h用密度梯度離心法分離出單個核細胞，置含20%胎牛血清RPMI1640培養液（由美國Invitrogen公司生產，貨號：12633-012）中培養24 h，取懸浮細胞即為淋巴細胞。②待骨髓間充質干細胞生長到80%-90%融合時，進行絲裂霉素C處理，并依據不同濃度將其接種于孔板中（96孔）；淋巴細胞懸浮于RPMI1640中，然后分別與研究組、對照組骨髓間充質干細胞接種，刺激淋巴細胞轉化濃度控制為5 ug/mL，在培養箱中培養96 h，然后在培養結束前12 h記錄cpm值[2]。

（5）觀察間充質干細胞對臍血造血細胞體外擴增的影響：①臍血單個核細胞的制備同上，然后取3-6代研究組患兒與對照組1mL骨髓間充質干細胞懸液接種于24孔板，并用絲裂霉素C處理，然后將不同培養體系的臍血單個核細胞接種于培養板（24孔）。實驗分為三組：臍血單個核細胞+細胞因子組合組，為第1組；臍血單個核細胞+對照組骨髓間充質干細胞+細胞因子組合組，為第2組；臍血單個核細胞+研究組患兒骨髓間充質干細胞+細胞因子組合組，為第3組，其中間充質干細胞數量均為2×105，均置于培養箱中培養7 d。②細胞收集。先吸出非貼壁細胞，以0.25%的胰酶消化貼壁細胞，吹打成單個核細胞懸液加入低糖DMEM培養基中置培養箱中培養，1 h后取上層非貼壁細胞與之前吸出的非貼壁細胞進行混合即為擴增后細胞。③造血祖細胞集落培養。取1×106個經培養擴增7d的細胞接種于培養基中，每孔1 mL，復種3孔，置培養箱中培養2周，鏡下對粒細胞巨噬細胞集落生成單位（CFU-GM）、紅系爆式集落生成單位（BFU-E）進行計數。

1.3 數據處理方法

2 結果

2.1 再生障礙性貧血患兒骨髓間充質干細胞生物學特點

研究組患兒骨髓間充質干細胞原代培養2-3 d后，鏡下可見貼壁細胞呈短梭形，單個或成群存在、增殖迅速，培養至10 d細胞擴大融合成單層，至20 d時瓶底基本被鋪滿，融合達80%-90%。傳代培養后細胞呈長梭形，呈放射性或漩渦狀迅速生長[3]。

2.2 再生障礙性貧血間充質干細胞對臍血造血細胞體外擴增的影響

在相同細胞因子組合作用下，對照組骨髓間充質干細胞與臍血間充質干細胞培養擴增后的CFU-GM和BFU-E產率高于研究組和單純細胞因子組（P＜0.05），見表1。

表1 研究組患兒間充質干細胞對臍血造血細胞擴增的影響

3 討論

再生障礙性貧血的發病機制，臨床上有種子學說（造血干細胞內的增殖能力受損）、蟲子學說（免疫機制紊亂）以及土壤學說（造血微環境缺陷）等觀點。目前，臨床較為普遍的觀點認為免疫異常在再生障礙性貧血的發病中起關鍵作用，尤其是免疫系統中的T淋巴細胞，其可對造血系統產生攻擊性損害，并產生大量造血負調控因子，從而參與再障礙的發病過程[5]。

有研究表明，骨髓間充質干細胞為造血微循環中的重要一環，參與調節造血干細胞的生長與分化。臨床上對于再障兒的研究多集中于免疫抑制異常，其骨髓間充質干細胞的生物學特性研究較少[6]。

綜上所述，再障兒與健康者的骨髓間充質干細胞的生物學特性無顯著區別，而前者對臍血淋巴細胞轉化的抑制效應和體外造血支持作用低于后者。