肺動脈高壓大鼠肺組織中TGF撥1和IL6的表達水平及意義

鄧凱 鄒勇 廖志新 鄭常龍

【摘要】目的研究轉化生長因子β1（TGFβ1）和IL6在野百合堿誘導的肺動脈高壓（PAH）大鼠肺組織中的表達水平及意義。方法22只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組（n=6）、野百合堿3周組（MCT3w組，n=8）和MCT5w組（n=8），皮下注射野百合堿復制肺動脈高壓模型。檢測右心室收縮壓（RVSP）和右心室肥厚指數（RVHI），左肺組織經固定包埋切片后行van Geison染色，光鏡下觀察肺內小動脈病理改變，計算肺內小動脈血管壁厚度占血管直徑的百分比（WT%）和血管壁面積占小動脈總橫截面積的百分比（WA%）。蛋白免疫印跡法檢測右肺組織TGFβ1表達水平，ELISA檢測肺組織中IL6表達水平。 結果與正常對照組相比，MCT3w組和MCT5w組大鼠的RVSP和RVHI均升高（P<005），肺小動脈中膜增厚，WT%和WA%均增加（P均<005），肺組織中TGFβ1和IL6表達水平均上調（P均<005）；與MCT3w組相比，上述指標在MCT5w組增高更明顯（P均<005）。 結論TGFβ1和IL6在野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠肺組織中的表達水平均增高，TGFβ1和IL6可能參與了PAH的發病和進展。

【關鍵詞】轉化生長因子β1；白介素6；肺動脈高壓；野百合堿

Expression level and significance of transforming growth factorβ1 and interleukin6 in lung tissues of rats with pulmonary hypertensionDeng Kai， Zou Yong， Liao Zhixin， Zheng Changlong Institute of Infectious Diseases， the Eighth Peoples Hospital of Guangzhou， Guangzhou Medical Univevsity， Guangzhou 510060， China

Corresponding author， Zheng Changlong， Email： zhengchanglong@163com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression level and significance of transforming growth factorbeta 1（TGFβ1） and interleukin6 （IL6）in the lung tissues of rat models with pulmonary hypertension induced by monocrotaline MethodsTwentytwo male SD rats were randomly divided into the normal control group（n=6）， 3week monocrotaline group（MCT3w group， n=8）and 5week monocrotaline group（MCT5w group， n=8） Pulmonary hypertension rat models were established by subcutaneous injection of monocrotaline The right ventricular systolic pressure（RVSP）and right ventricular hypertrophy index（RVHI）were measured The left lung tissue sections were stained with van Geison staining The pathological changes of the pulmonary arterioles were observed under optical microscope The percentage of wall thickness （WT%） of pulmonary arterioles to the vascular diameter and wall area （WA%） to the total crosssectional area of pulmonary arterioles was calculated The expression level of TGFβ1 in the right lung tissues was quantitatively detected by Western blot The concentration of IL6 in the lung tissues was measured by ELISA ResultsCompared with the normal control group， the RVSP and RVHI were significantly elevated （both P<005）， the middle membrane of pulmonary arterioles was considerably thickened， the WT% and WA% were significantly increased （both P<005） and the expression levels of TGFβ1 and IL6 in the lung tissues were evidently upregulated （both P<005） in the MCT3w group and MCT5w group Compared with the， the parameters above were significantly increased in the MCT5w group （all P<005） ConclusionsThe expression levels of TGFβ1 and IL6 are significantly upregulated in the lung tissues of rats with pulmonary hypertension induced by monocrotaline TGFβ1 and IL6 may be involved in the pathogenesis and progression of pulmonary hypertension

【Key words】Transforming growth factorbeta 1； Interleukin6； Pulmonary hypertension；

Monocrotaline

肺動脈高壓（PAH）是一種嚴重的進展性疾病，其主要病理生理特征為肺內小血管管腔縮窄、重構導致肺血管阻力進行性增高，甚至右心衰竭和死亡[12]。PAH的發病與多種因素有關，至今仍未完全闡明[12]。近年多項研究顯示，PAH的發病可能與多種炎癥因子有關[3]。野百合堿是一種生物堿，由于其誘導產生的PAH與人類特發性PAH最為接近而被廣泛應用于建立PAH的動物模型[4]。本研究將在野百合堿誘導的大鼠PAH模型中觀察TGFβ1和IL6表達情況，并探討其意義。

材料與方法

一、實驗動物和材料

本實驗所用的雄性SD大鼠（7周齡，體質量220～250 g）由中山大學實驗動物中心提供，并飼養于該中心SPF級動物房。飼養環境為恒溫（22±2）℃，恒濕（55±5）%，每日照明12 h，自由飲水、進食。野百合堿購自美國Sigma公司；TGFβ1和GAPDH抗體購自美國CST公司；IL6 ELISA試劑盒購自美國Abcam公司。本動物實驗經中山大學實驗動物倫理委員會批準，并根據中山大學動物實驗中心的實驗動物操作標準進行。

二、動物分組和建立模型

使用隨機數字表法將22只雄性SD大鼠分為3組：正常對照組（n=6）、野百合堿3周組（MCT3w組，n=8）和野百合堿5周組（MCT5w組，n=8）。其中，MCT3w組和MCT5w組大鼠分組后一次性經腹部皮下注射野百合堿60 mg/kg建立PAH模型，正常對照組皮下注射生理鹽水60 mg/kg作對照。MCT3w組在野百合堿注射3周后到達實驗終點，MCT5w組和正常對照組在野百合堿注射5周后到達實驗終點。

三、右心室收縮壓（RVSP）和右心室肥厚指數（RVHI）的測定

大鼠稱重后，腹腔內注射戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，并將大鼠固定于小動物手術臺，游離出右側頸外靜脈，遠心端用手術線結扎，顯微手術剪剪開頸外靜脈1/3，將已充盈肝素鈉的聚乙烯導管（PE100）從右頸外靜脈插入，經上腔靜脈、右心房插入右心室，導管連接換能器，通過PowerLab生物信號采集系統，待波形穩定后記錄RVSP。處死大鼠后分離大鼠心臟，剪去左、右心房及大血管根部，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗干凈后將心室剪為右心室游離壁（RV）和左心室加室間隔（LV+S）2部分，分析天平稱重后計算兩者的比值即為右心室肥厚指數[RVHI= RV/（LV+S）]。

四、肺小動脈形態學觀察

游離出大鼠肺臟，4 ℃ PBS反復沖洗，右肺組織經液氮冷凍后迅速轉至-80℃冰箱凍存備用。剪取左下肺組織（厚度約05 cm），PBS沖洗干凈后放入4%多聚甲醛中固定12 h，分別經50%、75%、95%、100%乙醇脫水、浸蠟、包埋，切片行van Geison染色，在光學顯微鏡下觀察肺內小動脈的病理改變，先在低倍鏡下挑選，然后在高倍鏡下選擇直徑在50～100 μm的肺小動脈拍照并分析。每張切片選取15～20根肺小動脈，運用圖像分析軟件分別測量肺內小動脈的血管壁厚度（WT）、血管直徑（ED），并計算血管壁厚度占血管直徑的百分比（WT%）、肺內小動脈的環形血管壁面積（LA）占小動脈總橫截面積（TA）的百分比（WA%）。WT%和WA%按以下公式計算：WT（%）=2×WT/ED×100%；WA（%）=（TA-LA）/TA×100%。

五、肺組織中TGFβ1表達水平檢測

取約50 mg右肺組織，加入400 μl組織蛋白裂解液，在研磨器中充分研磨、4 ℃靜置30 min，4℃ 12 000轉/分高速離心后提取總蛋白質。測定蛋白濃度后，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法將等量蛋白質進行分離并轉移至PVDF膜上，用含10 g/L小牛血清白蛋白的TBST溶液封閉2 h后，分別加入抗TGFβ1和GAPDH抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。TBST溶液洗滌后加入二抗稀釋液（1∶8 000），輕輕搖動2 h后用TBST洗膜4次，最后用化學底物進行發光顯跡。用IBAS圖像處理系統對膠片進行掃描后應用Image圖像分析軟件分析各條帶的灰度值進行比較。

六、肺組織中IL6表達水平檢測

取約100 mg右肺組織加冰生理鹽水1 ml制成100 g/L組織勻漿，用ELISA檢測肺組織中IL6表達水平。

七、統計學處理

使用SPSS 190分析數據。計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析，多重比較采用LSDt檢驗。P<005為差異有統計學意義。

結果

一、各組大鼠的RVSP和RVHI比較

到達實驗終點時，MCT3w組和MCT5w組分別有1只和2只大鼠死亡，正常對照組無大鼠死亡。與正常對照組相比，MCT3w組大鼠的RVSP和RVHI均升高（P均<005），表明PAH模型建立成功，而與MCT3w組相比，MCT5w組大鼠的RVSP和RVHI進一步升高（P均<005），見表1。

二、各組大鼠的肺內小動脈形態學比較

3組的WT%和WA%比較差異均有統計學意義（F值分別為25076和37883，P均<0001）。與正常對照組相比，MCT3w組大鼠的肺小動脈中膜增厚，WT%和WA%增加，而與MCT3w組相比，MCT5w組大鼠的肺小動脈中膜進一步增厚，WT%和WA%增加（P均< 005），見圖1。

表1各組大鼠的RVSP和RVHI的比較（±s）組別nRVSP（mm Hg）RVHI正常對照組6168±18026±003MCT3w組7336±37a041±004aMCT5w組6421±50ab058±006abF值7151176671P值<0001<0001注：與正常對照組相比，aP<005；與MCT3w組相比，bP<005

三、各組大鼠肺組織TGFβ1表達水平比較

3組的TGFβ1表達水平比較差異具有統計學意義（F=128935，P<0001）。與對照組相比，MCT3w組大鼠肺組織中TGFβ1的表達上調，而MCT5w組大鼠肺組織中TGFβ1表達比MCT3w組進一步增加（P<005），見圖2。

四、各組大鼠肺組織上清液中IL6表達水平比較

正常對照組、MCT3w組、MCT5w組大鼠肺組織上清液的IL6表達水平分別為（49±14）、（119±18）、（208±21）ng/L，3組的IL6表達水平比較差異有統計學意義（F=78864，P<

圖1各組大鼠肺內小動脈的形態變化（van Geison 染色，×400）

A：正常對照組；B：MCT3w組；C：MCT5w組；D：各組WT%和WA%的比較；與正常對照組相比，*P<005；與MCT3w組相比，#P<005

圖2TGFβ1在各組大鼠肺組織表達水平比較

A：蛋白免疫印跡法檢測結果；B：掃描后光密度比值的比較；與正常對照組相比，*P<005；與MCT3w組相比，#P<005

0001）。與對照組相比，MCT3w組大鼠肺組織中IL6表達水平增加（P<005），而MCT5w組大鼠肺組織中IL6表達水平比MCT3w組進一步增加（P<005），見圖3。

圖3IL6在各組大鼠肺組織的表達情況

與正常對照組相比，*P<005；與MCT3w組相比，#P<005

討論

野百合堿是一種生物堿，本身并無生物學活性，但其在體內經肝臟代謝后生成有活性的吡咯野百合堿，可使肺血管內皮細胞損傷、血管平滑肌異常增殖，從而導致血管重構和PAH[4]。本研究中，MCT3w組和MCT5w組大鼠與正常對照組相比，RVSP和RVHI均增高、肺小動脈中膜增厚，表明本研究的PAH模型已建立成功。TGFβ1和IL6在MCT3w組和MCT5w組肺組織中的表達水平均升高，而且在MCT5w組中升高更明顯，提示TGFβ1和IL6可能參與PAH的發病，而且TGFβ1和IL6的表達水平與PAH的進展可能相關。

TGFβ1是一種多功能細胞活性調節因子，可通過各種受體和細胞外信號分子參與細胞的增殖、遷移和分化等活動[5]。越來越多的證據表明，TGFβ1信號通路異常與PAH的發病機制有關[6]。TGFβ1可通過調控多種信號通路抑制內皮細胞的凋亡、促進血管平滑肌細胞異常增殖、 增加細胞外基質沉積等過程，從而促進PAH的形成和發展[78]。相反，通過抑制TGFβ1及其下游信號分子的表達，可減緩血管平滑肌細胞的異常增殖、減少細胞外基質的沉積[9]。本研究進一步證實，隨著疾病的進展和肺動脈壓力的進一步增高，TGFβ1在肺組織中的表達也增多。由此可見，TGFβ1在PAH發生和發展中有重要作用，TGFβ1有望成為PAH治療的新靶點。

IL6是由活化的T細胞和成纖維細胞產生的細胞因子，可通過介導炎癥、促進血管平滑肌細胞增殖等機制在PAH發病中發揮重要作用[1011]。有研究者發現，在特發性 PAH患者血清和肺組織中IL6的表達增加[12]。本研究證實在野百合堿誘導的大鼠肺組織IL6水平顯著增加，而且隨著病程進展，IL6水平進一步增加。因此推測，IL6可能參與了PAH的發病及進展，通過降低肺組織IL6的濃度可能會降低肺動脈的壓力，阻止PAH的進展。

綜上所述，在野百合堿誘導的PAH模型中，大鼠肺組織中TGFβ1和IL6表達水平升高，TGFβ1和IL6可能參與PAH的發生和進展，有望成為PAH的治療靶點。

參考文獻

[1]Schermuly RT， Ghofrani HA， Wilkins MR， Grimminger F Mechanisms of disease： pulmonary arterial hypertensionNat Rev Cardiol，2011，8（8）：443455

[2]周敏，徐永健 肺動脈高壓的治療進展：呼吸系統疾病（6）新醫學，2006，37（1）：5759

[3]Voelkel NF， Tamosiuniene R， Nicolls MRChallenges and opportunities in treating inflammation associated with pulmonary hypertensionExpert Rev Cardiovasc Ther，2016，14（8）：939951

[4]NogueiraFerreira R， Vitorino R， Ferreira R， HenriquesCoelho T Exploring the monocrotaline animal model for the study of pulmonary arterial hypertension： a network approachPulm Pharmacol Ther，2015，35：816

[5]Kajdaniuk D， Marek B， BorgielMarek H， KosKuda B Transforming growth factor β1 （TGFβ1） in physiology and pathologyEndokrynol Pol，2013，64（5）：384396

[6]Gilbane AJ， DerrettSmith E， Trinder SL， Good RB， Pearce A， Denton CP， Holmes AMImpaired bone morphogenetic protein receptor Ⅱ signaling in a transforming growth factorβdependent mouse model of pulmonary hypertension and in systemic sclerosisAm J Respir Crit Care Med，2015，191（6）：665677

[7]王丹姝，方蓮花，杜冠華轉化生長因子β1在肺動脈高壓中作用的研究進展中國藥理學通報，2017，33（6）：741744

[8]雷豐豐，張啟菎，萬毅新。轉化生長因子β1與肺纖維化新醫學，2003，34（11）：715716

[9]Li XW， Du J， Hu GY， Hu CP， Li D， Li YJ， Li XH Fluorofenidone attenuates vascular remodeling in hypoxiainduced pulmonary hypertension of ratsCan J Physiol Pharmacol，2014，92（1）：5869

[10]Hagen M， Fagan K， Steudel W， Carr M， Lane K， Rodman DM， West JInteraction of interleukin6 and the BMP pathway in pulmonary smooth muscleAm J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2007，292（6）：L1473L1479

[11]HashimotoKataoka T， Hosen N， Sonobe T， Arita Y， Yasui T， Masaki T， Minami M， Inagaki T， Miyagawa S， Sawa Y， Murakami M， Kumanogoh A， YamauchiTakihara K， Okumura M， Kishimoto T， Komuro I， Shirai M， Sakata Y， Nakaoka YInterleukin6/interleukin21 signaling axis is critical in the pathogenesis of pulmonary arterial hypertensionProc Natl Acad Sci U S A，2015，112（20）：E2677E2686

[12]Humbert M， Monti G， Brenot F， Sitbon O， Portier A， GrangeotKeros L， Duroux P， Galanaud P， Simonneau G， Emilie DIncreased interleukin1 and interleukin6 serum concentrations in severe primary pulmonary hypertensionAm J Respir Crit Care Med，1995，151（5）：16281631