柚皮苷在大鼠在體單向腸灌流模型上的吸收特征研究

陳潤芝 尚雅云 李綺杏 黎醒 趙潔

中圖分類號 R945 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）09-1194-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.09.10

摘 要 目的：研究柚皮苷在大鼠在體單向腸灌流模型上的吸收特征。方法：建立檢測大鼠腸道灌流樣品中柚皮苷、柚皮素含量的超高效液相色譜法，采用大鼠在體單向腸灌流模型，考察柚皮苷（10 μmol/L）的腸道（十二指腸、空腸、回腸、結腸）吸收及代謝特征[表觀滲透系數（Peff）、吸收率、代謝率]。結果：柚皮苷、柚皮素在1.25～40、1.25～40 μmol/L濃度范圍內線性關系良好（R2=0.999 4、0.996 6），檢測限分別為0.5、0.4 μmol/L，定量限均為1.25 μmol/L，日內、日間精密度和回收率及在HBSS液及其小腸、結腸灌流液中的穩定性均符合相關要求。柚皮苷在大鼠十二指腸、空腸、回腸、結腸中的Peff分別為（0.28±0.19）、（0.71±0.17）、（0.30±0.02）、（0.59±0.19）（n=6），差異無統計學意義（P>0.05）；吸收率分別為（2.90±2.14）%、（6.38±3.61）%、（3.69±0.56）%、（6.64±2.12）%（n=6）；柚皮苷在大鼠4個腸段均可被代謝為柚皮素，代謝率分別為（2.98±1.51）%、（2.53±1.31）%、（2.24±1.33）%、（0.70±0.20）%（n=6）。柚皮苷在十二指腸中的吸收率最低，代謝率最高，與結腸比較差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：柚皮苷在大鼠腸道滲透性差、吸收不佳；柚皮苷在大鼠腸道無特定吸收部位，在小腸和結腸中均可被代謝為柚皮素，但小腸的代謝率明顯高于結腸。

關鍵詞 柚皮苷；大鼠；在體單向腸灌流模型；吸收；代謝

ABSTRACT OBJECTIVE： To study absorption characteristics of naringin in situ single-pass intestinal perfusion model of rats. METHODS： UPLC method was established for the content determination of naringin and naringenin in intestinal perfusion samples of rats. The in situ single-pass intestinal perfusion model of rats was adopted to investigate intestinal （duodenum， jejunum， ileum and colon） absorption and metabolic characteristics [apparent permeability coefficient （Peff）， absorptivity， metabolic rate] of naringin （10 μmol/L）. RESULTS： The linear range of naringin and naringenin were 1.25-40， 1.25-40 μmol/L （R2=0.999 4， 0.996 6）. The detection limit were 0.5， 0.4 μmol/L， and limit of quantitation were all 1.25 μmol/L. Precision of inter-day and intra-day， recovery and stability in HBSS solution， perfusion fluid of small intestine and colon were all in line with the standard. Peff of naringin in duodenum， jejunum， ileum and colon of rats were （0.28±0.19）， （0.71±0.17）， （0.30±0.02）， （0.59±0.19）（n=6）， without statistical significance （P>0.05）. Absorptivities were （2.90±2.14）%，（6.38±3.61）%，（3.69±0.56）%，（6.64±2.12）%（n=6）. Naringin could be metabolized to naringenin in 4 intestinal segments of rats， with metabolic rate of （2.98±1.51）%，（2.53±1.31）%，（2.24±1.33）%，（0.70±0.20）% （n=6）. The lowest absorptivity and the highest metabolic rate of naringin were occurred in the duodenum， there were statistical significance compared with colon （P<0.05）. CONCLUSIONS： Naringin shows poor permeability and poor absorption in the intestinal tract of rats. There was no specific absorption site in the rats intestines for naringenin； naringin could be metabolized to naringenin in small intestine and colon， but metabolic rate of naringin in small intestine is higher than in colon.

KEYWORDS Naringin； Rat； In situ single-pass intestinal perfusion model； Absorption； Metabolism

柚皮苷（Naringin）為雙氫黃酮類化合物，是蕓香科柑橘屬植物的次生代謝產物[1]。其廣泛存在于柑橘屬植物橘、橙等的果皮和果肉中，同時也是中藥枳實、枳殼、化橘紅和陳皮等的主要有效成分。柚皮苷不僅資源豐富、來源廣泛，還具有降血脂、抗炎、抗氧化、抗真菌、抗動脈粥樣硬化以及抗纖維化等多種藥理活性[2-4]。柚皮苷是很有開發前途的黃酮類成分，但藥動學研究表明，柚皮苷生物利用度較低（低于5%），這在很大程度上限制了其開發利用[5]。吸收是影響有效成分口服生物利用度的關鍵因素之一，因此，本研究采用大鼠在體單向腸灌流模型考察了柚皮苷的腸道吸收特征，以期明確柚皮苷的腸道吸收特征，為解釋柚皮苷的腸道吸收機制提供實驗基礎，也可為更好地開發柚皮苷提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器

Acquity超高效液相色譜（UPLC）儀（美國Waters公司）；PHD22/2000精密多通道注射泵（美國哈佛儀器公司）；BT25S電子分析天平（德國賽多利斯公司）；5810R低溫高速離心機 （德國Eppendorf公司，離心半徑：11.50 cm）；Milli-Q Grandient A10超純水系統（美國Millipore公司）；WS27-2水浴搖床（美國Shellab公司）；FE20 pH 計（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 藥品與試劑

柚皮苷對照品（批號：MUST-16041912，純度：98.28%）和柚皮素對照品（批號：MUST-16032406，純度：99.18%）均由成都曼斯特生物科技有限公司提供；睪酮對照品 （批號：H1206043，純度：98%）、烏拉坦對照品（批號：C1230017，純度：99%）和甲酸（批號：L1609048，純度：≥98%）均由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；Hanks 平衡鹽（批號：SLBN5152）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，批號：SLBN4578V，純度：≥99.5%）、氯化鈉（批號：SLBJ0082V，純度：≥99.0%）、葡萄糖（批號：SLBJ9903V，純度：≥99.5%）和碳酸氫鈉（批號：028K0007V，純度：≥99.0%）均由美國Sigma公司提供；甲醇（批號：1674607308，純度：≥99.9%）和乙腈（批號：1678130312，純度：≥99.9%）均由德國Merck公司提供，其余試劑均為分析純。

1.3 動物

SD大鼠，SPF級，♂，體質量260～300 g，由南方醫科大學動物實驗中心提供，動物生產許可證號為SCXK（粵）2011-0015。大鼠自由進食、飲水，適應性飼養1周后開始實驗。本實驗通過南方醫科大學實驗動物中心動物倫理委員會的批準與同意。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1 %甲酸（B），梯度洗脫（0～1 min，30%A；1～1.5 min，45%A；1.5～2.5 min，45%A；2.5～3.5 min，30%A）；流速：0.3 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 柚皮苷貯備液 精密稱取柚皮苷對照品20 mg，以二甲基亞砜（DMSO）-甲醇（1 ∶ 4，V/V，下同）溶液溶解，制備成5 mmol/L的柚皮苷貯備液，置于冰箱中（4 ℃），備用。

2.2.2 柚皮素貯備液 精密稱取柚皮素對照品20 mg，以DMSO-甲醇溶液溶解，制備成5 mmol/L的柚皮素貯備液，置于冰箱中（4 ℃），備用。

2.2.3 內標溶液 精密稱取睪酮對照品14.42 mg，加入10 mL甲醇溶液，制備成5 mmol/L的內標溶液，置于冰箱中（4 ℃），備用。

2.2.4 HBSS液 按Hanks平衡鹽說明要求，用水稀釋，并調pH為6.5制成HBSS液。

2.3 大鼠腸道灌流樣品的處理

精密吸取大鼠腸道灌流樣品500 μL，加入100 μL內標溶液，1 500 r/min渦旋30 s，混勻，13 000 r/min離心30 min，取上清液進樣測定。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性 分別取大鼠空白腸道灌流液、空白腸道灌流液+10 μmol/L柚皮苷+10 μmol/L柚皮素以及大鼠灌流10 μmol/L柚皮苷后60 min的十二指腸灌流液，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。結果，在該色譜條件下，柚皮苷及其代謝產物柚皮素以及內標睪酮的保留時間分別為0.60、1.96、2.52 min，三者分離情況良好，分離度均大于1.5，大鼠十二指腸灌流液中的內源性物質不干擾柚皮苷、柚皮素及內標睪酮的測定，表明本方法專屬性好。色譜圖見圖1。

2.4.2 線性關系、檢測限與定量限 按相關方法考察，以柚皮苷或柚皮素的峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標（y）、柚皮苷或柚皮素的濃度為橫坐標（x）進行線性回歸。得到在HBSS液中柚皮苷、柚皮素的回歸方程分別為y=3.611 6x-1.919 4（R2=0.999 4）、y=3.644 1x-3.246 6（R2=0.996 6），檢測濃度的線性范圍為1.25～40、1.25～40 μmol/L，檢測限為0.5、0.4 μmol/L，定量限均為1.25 μmol/L，可滿足大鼠腸道灌流液測定的靈敏度要求。

2.4.3 精密度與準確度 將柚皮苷貯備液精密添加至大鼠空白腸道灌流液中，制備成低、中、高濃度（2.5、10、40 μmol/L）的樣品溶液。按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，同日內測定6次以考察日內精密度，連續測定3 d以考察日間精密度。將所得的峰面積比代入回歸方程計算濃度，以測得濃度與實際濃度的比值計算回收率。精密度與準確度試驗結果見表1。同法考察柚皮素，結果均符合相關要求。

2.4.4 穩定性 將柚皮苷貯備液精密添加至HBSS液中，制備成低、中、高濃度（2.5、10、40 μmol/L）的樣品溶液，室溫下放置0、2、4、6 h后，按“2.3”項下方法處理，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算含量考察柚皮苷的化學穩定性。將10 μmol/L的柚皮苷溶液添加到4個空白腸道（十二指腸、空腸、回腸、結腸）灌流液以及4個腸段等體積混合的腸道灌流液中，同上檢測室溫6 h內的生物穩定性。結果表明，柚皮苷在HBSS、4個腸段的空白腸道灌流液以及混合腸道灌流液中含量的RSD均小于15.00%。穩定性試驗結果見表2。同法考察柚皮素，結果均符合相關要求。

2.4.5 吸附性 將柚皮苷貯備液添加至HBSS液中，制備成低、中、高濃度（2.5、10、40 μmol/L）的樣品溶液，分別置于玻璃管和塑料離心管中，平行3份，放置48 h后，按“2.3”項下方法處理，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算含量。結果表明，玻璃管和塑料離心管對柚皮苷基本無吸附。吸附性試驗結果見表3。同法考察柚皮素，結果均符合相關要求。

2.5 大鼠在體單向腸灌流實驗

2.5.1 實驗方法 取健康SD大鼠，術前禁食12～16 h，自由飲水，腹腔注射烏拉坦溶液麻醉，固定，置于電熱毯上，保持正常體溫。沿腹中線切口4 cm打開腹腔，分別在十二指腸、空腸、回腸和結腸兩端插入聚乙烯管，無菌手術線固定，用生理鹽水沖洗腸道，并用生理鹽水浸漬的紗布覆蓋腸組織表面，采用恒速多通道注射泵恒速灌流腸腔，以含10 μmol/L 柚皮苷的HBSS液（pH 6.5）進行灌流，流速為10 mL/h，平衡30 min后，收集灌流60、90、120、150 min的出口腸道灌流樣品。為防止腸道中的酶、蛋白、腸道微生物對藥物的水解，在收集前先在收集管中加入2 mL終止液（6%甲酸-94%乙腈），記錄收集到的腸道灌流樣品質量。實驗結束后，剪下各腸段，測量并記錄各腸段長度。

2.5.2 數據處理 采用重量法校正腸道水分變化，計算十二指腸、空腸、回腸和結腸的表觀滲透系數（Peff）、吸收率（%）和代謝率（%）。

Peff=（1-cm/c0）/4Gz，Gz=π×D×L/2Q，Q=c0×間隔時間×流速

吸收率（%）=（1-cm/c0）×100%

代謝率（%）=c代謝產物/c0×100%

式中，c0和cm分別代表腸腔入口和出口處柚皮苷的濃度；c代謝產物為出口處代謝產物（柚皮素）的濃度；Gz即Graetz 系數，是與流量（Q）、腸道長度（L）和擴散系數（D）有關的轉換系數。

2.5.3 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。正態計量指標以x±s表示，多組間比較采用單因素分析，組間兩兩方差齊時，兩兩比較采用LSD法，方差不齊時采用Durulett T3法，顯著性水平α=0.05，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2.5.4 結果 柚皮苷在大鼠十二指腸、空腸、回腸、結腸的滲透性均較差、吸收不佳，在4個腸段中的Peff差異無統計學意義（P>0.05），表明柚皮苷在大鼠腸道無特定吸收部位；另外，在上述4個腸段的腸道灌流樣品中均可檢測到柚皮素，表明柚皮苷在十二指腸、空腸、回腸、結腸中均可被代謝為柚皮素，但不同腸段間代謝率存在差異，其中十二指腸代謝率最高，結腸代謝率最低。柚皮苷在大鼠腸道中的吸收與代謝參數結果見表4。不同時間點柚皮苷在大鼠腸道中的吸收量與代謝量見表5。

3 討論

評價藥物在腸道吸收的方法有離體法、在體法和體內法等，在體法中，大鼠單向腸灌流法能很好地模擬人體的體內環境，且結果與人體試驗結果相關性良好，故被美國FDA認可作為藥動學中篩選藥物吸收特征的方法，廣泛應用于藥物吸收特征以及藥物排泄、代謝研究[6-7]。本研究采用大鼠在體單向腸灌流模型研究柚皮苷的腸道吸收特征，并應用重量法校正腸道水分變化，計算柚皮苷在十二指腸、空腸、回腸和結腸中的Peff、吸收率以及代謝率，可有效避免由于腸道吸收水分導致的對藥物吸收造成的誤差。

本研究選取濃度為10 μmol/L的柚皮苷為考察對象，主要是由于腸道中存在外排轉運蛋白，若底物濃度過高可能出現由于轉運蛋白被飽和導致的吸收結果不準確的現象。本研究結果表明，柚皮苷在大鼠各腸段的滲透性均較差、吸收不佳；這可能是因為柚皮苷水溶性大，親脂性較低，很難透過腸道屏障進入血液循環發揮藥效[8]。而且柚皮苷在大鼠各腸段的Peff無顯著性差異，表明柚皮苷在大鼠腸道無特定吸收部位。另外，筆者還發現，柚皮苷在不同腸段均可轉化為其苷元柚皮素。研究表明，柚皮苷在代謝酶的作用下，主要轉化成柚皮素，而柚皮素經過Ⅱ相代謝反應生成柚皮素葡萄糖醛酸化/硫酸化結合物[9-10]。此外，柚皮苷在腸道細菌的作用下也可代謝成為極性更低的柚皮素[11]，與柚皮苷相比，柚皮素具有脂溶性大、相對分子質量小的特點，故柚皮素經胃腸道的吸收速度較柚皮苷快并能更好地被腸道吸收，發揮藥理活性[12-13]。本研究結果表明，柚皮苷在不同腸段間的代謝率存在差異，在十二指腸中代謝率最高，而在結腸中代謝率最低。故筆者推測小腸對柚皮苷的代謝能力強于結腸對柚皮苷的代謝。

本研究采用大鼠在體單向腸灌流模型初步明確了柚皮苷的腸道吸收及代謝特征，為解釋柚皮苷的腸道吸收機制提供了實驗基礎，也為更好地開發柚皮苷提供了理論依據。

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（收稿日期：2017-10-12 修回日期：2017-12-04）

（編輯：鄒麗娟）