在線二維柱切換—高效液相色譜法測定人血清中多索茶堿濃度

鄭玲利 袁明勇 蔣婷 王峰 張維 陳靜

中圖分類號 R974+.3；R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）09-1264-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.09.27

摘 要 目的：建立測定人血清中多索茶堿濃度的方法。方法：采用在線二維柱切換-高效液相色譜法測定人血清中多索茶堿濃度，一維色譜柱為Waters C18，中間柱為SC2，一維、二維柱流動相均為甲醇-水（70 ∶ 30，V/V），檢測波長為273 nm，柱溫為40 ℃，進樣量為10 ?L。結果：多索茶堿在0.5～50.00 ?g/mL質量濃度范圍內與峰面積線性關系良好（r=0.999 9），檢測限為0.01 ?g/mL，定量限為0.5 ?g/mL，日內、日間精密度的RSD分別為1.51%～1.89%和1.52%～1.92%（n=5），準確度為97.91%～104.19%（n=5），提取回收率為91.63%～93.44%（RSD<2.00%，n=3），基質效應RSD≤3.01%（n=6），穩定性的RSD<5.00%（n=6）。3例患者靜脈輸注多索茶堿葡萄糖注射液（0.3 g/d）達穩態后，次日給藥前靜脈血清中多索茶堿的濃度為3.23、3.35、3.68 ?g/mL，RSD為2.28%、2.34%、2.14%（n=5）。結論：該方法簡便、快速、準確，適用于臨床多索茶堿的血藥濃度檢測。

關鍵詞 多索茶堿；血藥濃度；在線二維柱切換-高效液相色譜法

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for the determination of doxofylline in human serum. METHODS： Online two-dimensional column switching-HPLC was adopted to determine the concentration of doxofylline in human serum. First- dimensional chromatographic column was Waters C18 column， and middle column was SC2. First-dimensional and second- dimensional column mobile phrase were methanol-water （70 ∶ 30， V/V）. The detection wavelength was 273 nm， and column temperature was 40 ℃. Sample volume was 10 ?L. RESULTS： The linear range of doxofylline were 0.5-50.00 ?g/mL （r=0.999 9）， and the detection limit was 0.01 ?g/mL. The quantitative limit was 0.5 ?g/mL. RSDs of intra-day and inter-day were 1.51%-1.89% and 1.52%-1.92% （n=5）. The accuracy were 97.91%-104.19% （n=5）. Extraction recoveries rate were 91.63%-93.44%（RSD<2.00%，n=3）. RSD of matrix effect were lower than or equal to 3.01% （n=6）， and RSD of stability test was lower than 5.00% （n=6）. After 3 patients were given intravenous injection of Doxofylline and glucose injection（0.3 g/d） up to steady state， the serum concentrations of doxofylline were 3.23， 3.35， 3.68 ?g/mL before medication on the next day （RSD=2.28%， 2.34%， 2.14%， n=5）. CONCLUSIONS： The method is simple， rapid， accurate and suitable for the determination of plasma concentration of doxofylline.

KEYWORDS Doxofylline； Plasma concentration； Online two-dimensional column switching-HPLC

多索茶堿（Doxofylline）為甲基黃嘌呤的衍生物[1]，主要用于支氣管痙攣引起的呼吸困難[2]。作為新一代茶堿藥物，該藥具有療效高、副作用小等特點，故越來越被臨床所重視。但該藥與茶堿一樣，同樣存在個體差異較大，大劑量給藥時可能引起血壓下降、心律不齊、陣發性痙攣等[3]，故臨床需密切監測多索茶堿血藥濃度，防止過量導致不良反應的發生。目前，檢測血藥濃度主要采用高效液相色譜（HPLC）法[4-5]，但傳統的HPLC法存在前處理較復雜、常使用大量有機溶劑、殘留蛋白易堵塞色譜柱等問題。本研究通過對傳統血藥濃度檢測方法進行優化和改良，建立了一種簡便、快速、準確的檢測方法，適用于臨床多索茶堿的血藥濃度檢測。

1 材料

1.1 儀器

二維HPLC（2D-HPLC）由FLC-2801全自動二維液相色譜耦合儀（湖南德米特儀器有限公司）和LC-20A色譜模塊（日本島津公司）構成；HR-200電子分析天平（日本AND公司）；TD24-WS低速離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）；XW-80A旋渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司）；Mini-15K微型高速離心機（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

多索茶堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100345-200803，供含量測定用）；甲醇為色譜純；高氯酸、磷酸銨為分析純，水為純凈水。

1.3 血清與全血

空白馬血清（北京政博偉業生物科技有限公司，批號：160128）；空白人血清和用藥患者全血樣品（靜脈注射多索茶堿葡萄糖注射液每日0.3 g，達穩態后，次日給藥前0.5～1 h采血）由中南大學湘雅二醫院臨床科室提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

FLC-2801全自動二維液相色譜耦合儀，第一維色譜系統為島津LC-20ATvp四元低壓色譜泵，第二維色譜系統為島津LC-20ATvp一元低壓色譜泵。第一維柱系統：色譜柱為Waters C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（70 ∶ 30，V/V），流速為1.0 mL/min。第二維柱系統：流動相為甲醇-水（70 ∶ 30，V/V），不需要色譜柱，主要用于清洗中間柱；中間柱SC2（25 mm×3.5 mm，5 μm）；檢測波長為273 nm；柱溫為40 ℃；進樣量為10 μL。工作原理：（1）進樣。目標經過中間柱分離雜質后進入分析柱進行分析。（2）除雜。中間柱在目標物完全離開后轉至第二維柱系統進行反向沖洗，洗去殘留雜質。（3）返回。中間柱洗凈后返回第一維柱系統，為下一次進樣做準備，流程圖見圖1。在線二維柱切換-HPLC條件設置-時間程序表見表1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品貯備液 精密稱取多索茶堿對照品5 mg，用25%乙醇溶解并定容至10 mL，制備成質量濃度為500 ?g/mL的對照品貯備液，置于冰箱中（4 ℃），備用。

2.2.2 對照品溶液 取“2.2.1”項下對照品貯備液適量，用25%乙醇定容至10 mL，制備成高、中、低質量濃度（37.5、12.5、1.5 ?g/mL）的對照品溶液，轉移至密封螺口瓶中，置于冰箱中（-80 ℃）保存。

2.2.3 質控樣品溶液 取“2.2.1”項下對照品貯備液適量，用空白馬血清定容至10 mL，制備成高、中、低質量濃度（37.5、12.5、1.5 ?g/mL）的質控樣品溶液，轉移至密封螺口瓶中，置于冰箱中（-80 ℃）保存。

2.3 血清樣品處理方法

取全血樣品以離心半徑6 cm、轉速3 000 r/min離心5 min，精密量取待測血清樣品200 ?L，再置于離心管中，加入10%高氯酸600 ?L，渦旋振蕩1 min后，以離心半徑3 cm、轉速14 500 r/min離心8 min。取上清液700 μL至進樣瓶，加入5.0 mol/L磷酸銨溶液70 μL調節pH至7.0，渦旋振蕩15 s，進樣10 μL，以外標法定量分析。

2.4 專屬性考察

取空白馬血清、空白人血清、空白馬血清+多索茶堿對照品、用藥患者全血樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜。結果顯示，空白馬血清、空白人血清在目標峰處無干擾，多索茶堿與雜質分離較好，保留時間為8.794 min，色譜圖見圖2。

2.5 線性關系考察

取多索茶堿對照品貯備液適量，用空白馬血清定容，稀釋制成多索茶堿質量濃度分別為50.0、25.0、12.5、6.25、3.0、1.5、0.5 ?g/mL的系列溶液，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標（y）、多索茶堿質量濃度為橫坐標（x）進行線性回歸，得回歸方程為y=32 015x+1 669.85（r=0.999 9）。結果表明，多索茶堿在0.5～50.0 ?g/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.6 檢測限與定量限考察

取“2.5”項下多索茶堿標準曲線線性最低點的溶液逐倍稀釋，進行分析，以信噪比為3計算檢測限，以信噪比為10計算定量限。結果顯示，檢測限為0.01 ?g/mL，定量限為0.5 ?g/mL。

2.7 準確度與精密度試驗

取“2.2.3”項下高、中、低質量濃度的質控樣品溶液，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，每個質量濃度同日內連續測定5次考察日內精密度，5日內每日測定1次考察日間精密度；以回歸方程計算多索茶堿濃度，按公式實測濃度/理論濃度×100%計算準確度。準確度與精密度試驗結果見表2。

2.8 提取回收率試驗

取“2.2.3”項下高、中、低質量濃度的質控樣品溶液和“2.2.2”項下多索茶堿對照品溶液，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，將測得的同質量濃度質控品與對照品溶液的峰面積進行比較，計算提取回收率。結果顯示，高、中、低質量濃度質控樣品溶液的提取回收率分別為93.44%、92.25%、91.63%，RSD分別為1.9%、1.1%、1.8%（n=3），表明本方法的提取回收率較高且穩定。

2.9 基質效應考察

取6份不同的空白人血清和空白馬血清，按“2.3”項下方法處理后，加入多索茶堿對照品溶液制備成高、低質量濃度（37.5、1.5 ?g/mL）質控樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，以質控樣品溶液的峰面積與相同質量濃度多索茶堿對照品溶液的峰面積的比值計算基質效應。結果顯示，人血清、馬血清的RSD均小于15%，且兩者比較無顯著差異，故本試驗可用馬血清替換人血清作為質控基質。基質效應考察結果見表3。

2.10 穩定性考察

取“2.2.3”項下高、中、低質量濃度的質控樣品溶液，在室溫放置0、2、4、8、16、24 h及冷凍保存10 d（反復凍融3次）后，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析。結果顯示，質控樣品溶液峰面積的RSD均<5.00%（n=6），表明質控樣品溶液在室溫放置24 h及冷凍10 d的穩定性良好。

2.11 臨床樣本測定

取3例用藥患者的全血樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，代入回歸方程計算濃度。結果顯示，3例用藥患者的多索茶堿血藥濃度分別為3.23、3.35、3.68 ?g/mL，RSD分別為2.28%、2.34%、2.14%（n=5），血藥濃度均在本方法檢測范圍內，且重現性較好。

3 討論

多索茶堿是一種新型支氣管擴張藥，可直接作用與支氣管，促進支氣管平滑肌舒張，從而達到抑制哮喘發作[6]。但其治療范圍較窄，實際使用過程中易出現肝損害、心律失常等不良反應，需對其進行血藥濃度監測。已有研究報道采用HPLC法測定多索茶堿，但均存在前處理復雜、靈敏度低、色譜柱使用壽命較短等問題[5，7]。本方法采用高氯酸沉淀蛋白后直接進樣，不但避免有機溶劑萃取造成樣品的損失，而且不需要用微孔濾膜過濾，簡化了樣品處理過程，縮短了樣本處理時間。此外，本方法提取回收率高，回收率穩定，不需要加入內標，通過外標法就能達到較好的線性關系。

本試驗采用的在線二維柱切換-HPLC法，在普通HPLC分析柱前引入中間柱，中間柱除了對樣品具有分離功效外，還具有強大的除雜功能。當目標物全部通過中間柱后，中間柱帶著殘留的雜質從第一維柱系統轉移至第二維柱系統，通過流動相反向沖洗，大量的雜質從第二維柱系統中排入廢液，這不僅去除了大部分雜質的干擾，提高了分析的準確性，而且大大延長了分析柱和中間柱的壽命，節約了檢測成本。

本研究選擇馬血清作為血清基質，因為馬血清與人血清作為質控基質無明顯差異，而馬血清更容易獲得且已被衛生部質控中心采用，故試驗中采用馬血清配制的質控樣品。與文獻方法[5，7]比較，該方法試驗步驟更為簡單、檢測時間短、方法線性好、干擾少、準確，適用于臨床多索茶堿的血藥濃度檢測。

參考文獻

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（收稿日期：2018-01-22 修回日期：2018-03-14）

（編輯：鄒麗娟）