黃芪甲苷對D—半乳糖誘導原代培養心肌細胞凋亡的保護作用及機制研究

王曉霞 劉天龍 劉晶 劉小玲 張勇 肖云峰 劉小雷

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）09-1189-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.09.09

摘 要 目的：研究黃芪甲苷對D-半乳糖（D-gal）誘導原代培養心肌細胞凋亡的保護作用及機制。方法：分離和培養Wistar乳鼠原代心肌細胞，將細胞分為正常對照組（無血清DMEM高糖培養基）、D-gal組（含5 g/L D-gal的無血清DMEM高糖培養基）和黃芪甲苷低、中、高質量濃度組（分別先以含25、50、100 ?g/mL黃芪甲苷的無血清DMEM高糖培養基培養1 h，然后換為含有相應質量濃度黃芪甲苷和5 g/L D-gal的無血清DMEM高糖培養基）。采用CCK-8法檢測培養48 h后細胞活性，分別采用Hoechst染色法（培養24 h）和流式細胞術（培養48 h）考察細胞凋亡情況，采用實時熒光定量-聚合酶鏈式反應法檢測培養24 h后細胞中凋亡相關因子（Bcl-2、Bax、Caspase-3）和心房鈉尿肽（ANP） mRNA表達水平。結果：與正常對照組比較，D-gal組細胞的活性以及細胞中Bcl-2 mRNA水平、Bcl-2/Bax比值降低，細胞凋亡率和細胞中Bax、Caspase-3、ANP mRNA水平升高，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。與D-gal組比較，黃芪甲苷各濃度組細胞的活性以及細胞中Bcl-2 mRNA水平、Bcl-2/Bax比值均升高，細胞凋亡率和細胞中Bax、Caspase-3、ANP mRNA水平均降低，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01），且具有一定濃度依賴性。結論：黃芪甲苷對D-gal誘導的原代心肌細胞凋亡具有一定的保護作用，其機制可能與升高細胞中Bcl-2/Bax比值和下調細胞中Caspase-3、ANP mRNA的表達有關。

關鍵詞 黃芪甲苷；D-半乳糖；原代心肌細胞；凋亡；保護作用

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the protective effect and mechanism of astragaloside Ⅳ on D-galactose （D-gal）-induced primary cardiomyocytes apoptosis. METHODS： Wistar neonatal rat primary cardiomyocytes were isolated and cultured. The cardiomyocytes were divided into normal control group （DMEM high glucose medium without serum）， D-gal group （DMEM high glucose medium without serum containing 5 g/L D-gal） and astragaloside Ⅳ low-concentration， medium-concentration and high-concentration groups （after cultured with DMEM high glucose medium without serum containing 25， 50， 100 ?g/mL astragaloside Ⅳ for 1 h， and then replaced with DMEM high glucose medium without serum containing corresponding concentration of astragaloside Ⅳ and 5 g/L D-gal）. Cardiomyocytes activity was detected by CCK-8 kit after cultured for 48 h. The apoptosis level was detected by Hoechst staining （cultured for 24 h） and flow cytometry （cultured for 48 h）. The mRNA expressions of apoptosis related factors （Bcl-2， Bax， Caspase-3） and ANP in cardiomyocytes were detected by RT-PCR after cultured for 24 h. RESULTS： Compared with normal control group， the activity of cardiomyocytes， mRNA level of Bcl-2 and ratio of Bcl-2/Bax were decreased in D-gal group， while apoptosis rate and mRNA levels of Bax， Caspase-3 and ANP were increased， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）. Compared with D-gal group， the activity of cardiomyocytes， mRNA level of Bcl-2 and ratio of Bcl-2/Bax were increased in astragaloside Ⅳ groups， while apoptosis rate and mRNA levels of Bax， Caspase-3 and ANP were decreased， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）， and in concentration-dependent manner. CONCLUSIONS： Astragaloside Ⅳ can protect D-gal induced primary cardiomyocytes from apoptosis， the mechanism of which may be associated with the increase of Bcl-2/Bax ratio and the decrease of mRNA expressions of Caspase-3 and ANP.

KEYWORDS Astragaloside Ⅳ； D-galactose； Primary cardiomyocytes； Apoptosis； Protective effect

黃芪（Astragalus membranaceus）為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，是中蒙醫臨床處方中較重要的藥材，而黃芪甲苷（Astragaloside Ⅳ）是黃芪的主要有效成分之一[1]。黃芪皂苷在心血管疾病的治療中具有較大的應用潛力，有研究顯示，其能夠通過提高心肌細胞內Ca2+水平、抑制環磷腺苷水解、抗氧化應激及調節血壓和脂質代謝等方式對多種原因引起的心肌損傷、心力衰竭及生理性衰老等具有一定保護作用[2]。但上述研究多使用的是黃芪總皂苷，而對于黃芪皂苷單體的生物學活性研究報道較少。

凋亡在心血管疾病的發生和發展中扮演重要的作用，在動脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷、心肌肥厚、心肌梗死及心力衰竭等病理改變中均涉及心肌細胞的凋亡[3]。而且，在動物水平上通過藥物刺激、基因敲除或基因過表達等手段抑制心肌細胞凋亡對壓力誘導的心肌重構和心力衰竭具有很好的保護作用[4]。鑒于此，本研究以蒙古黃芪提取物——黃芪甲苷為研究對象，考察其對D-半乳糖（D-galactose，簡寫為D-gal）誘導的原代心肌細胞凋亡的保護作用并探討其可能的作用機制，這不僅是從天然產物中開發治療心血管疾病特異性藥物的基礎，而且對于開發內蒙古地區特色的中蒙藥資源有著重要的意義。

1 材料

1.1 儀器

RC低溫離心機（美國Sorvall公司）；JB-3電磁攪拌器（上海雷磁儀器廠）；Z360K高速冷凍離心機（德國Hermle公司）；Model550酶標儀（美國Bio-Rad公司）；Eclipse生物倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）；Accuri C6流式細胞儀（美國BD公司）；7500實時熒光定量聚合酶鏈式反應儀（美國Thermos公司）。

1.2 藥品與試劑

黃芪甲苷（本課題組提取，批號：20170106，純度：經高效液相色譜-質譜鑒定>98%）；CCK-8染色試劑盒（同仁化學研究所）； 熒光素FITC標記的膜聯蛋白Ⅴ（FITC-Annexin Ⅴ）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）；Hoechst 33342染色試劑（美國R&D公司）；Takara反轉錄試劑盒（日本Takara公司）；凋亡相關因子（Bcl-2、Bax、Caspase-3）、心房鈉尿肽（ANP）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物均由北京奧科生物技術有限公司提供；其他試劑均為分析純。

1.3 細胞

原代心肌細胞由本課題組依據文獻[5]從新生大鼠[購自內蒙古醫科大學實驗動物中心，動物質量合格證號：SCXK（蒙）2016-0001]心臟中分離和培養。

2 方法

2.1 原代心肌細胞的培養和鑒定

將原代心肌細胞差速貼壁后對其進行計數，以細胞密度為5×104個/mL分別接種于6、12、96孔板中，接種的量分別是2 mL、1 mL和100 μL，接種的細胞均使用含10%胎牛血清（FBS）、2×青鏈霉素混合液及2%的5-溴脫氧尿嘧啶核苷的DMEN高糖培養基進行培養。培養48 h后，使用無血清的培養基饑餓細胞24 h，然后用α-輔肌動蛋白（α-actinin）抗體對原代心肌細胞進行免疫組化染色，對其純度進行鑒定。采用倒置相差顯微鏡觀察培養不同時間后細胞的生長狀態和形態學變化，并拍照記錄。

2.2 黃芪甲苷對D-gal誘導原代心肌細胞活性改變的影響

將細胞接種在96孔板中，加入無血清培養基饑餓處理24 h，棄去培養基，將細胞分為正常對照組、D-gal組和黃芪甲苷低、中、高質量濃度組，每組均設置6個復孔。正常對照組細胞加入100 ?L無血清的培養基；D-gal組細胞加入含5 g/L D-gal的無血清培養基100 ?L[6]；黃芪甲苷低、中、高質量濃度組細胞先分別加入含25 、50、100 ?g/mL黃芪甲苷的無血清培養基100 ?L，作用1 h，然后更換為含相應黃芪甲苷濃度和5 g/L D-gal的無血清培養基。各組細胞均在37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養48 h，吸棄培養基，每孔加入含有10% CCK-8試劑的無血清培養基100 ?L，在37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養1.5 h后，用酶標儀測定450 nm波長處各孔的吸光度值。

2.3 黃芪甲苷對D-gal誘導原代心肌細胞凋亡的影響

2.3.1 Hoechst 33342染色法 將細胞接種于12孔板中，加入無血清培養基饑餓處理24 h，然后按“2.2”項下分組處理，每個濃度設置3個復孔。將細胞培養48 h后棄去培養基，用預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗細胞1次，4%多聚甲醛溶液固定細胞20 min，棄去固定液，用PBS洗細胞2次，每次3 min，吸棄PBS，每孔加入0.25 mL Hoechst 33342染色液，混勻，在37 ℃、5%CO2細胞培養箱中避光培養30 min，棄染色液，PBS洗細胞3次，每次3 min，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞染色情況并拍照。

2.3.2 流式細胞術 將細胞接種于6孔板中，加入無血清培養基饑餓處理24 h，然后按“2.2”項下方法分組、給藥，每個濃度設置3個復孔。將細胞培養48 h后棄去培養基，用預冷的PBS洗細胞1次，胰酶消化細胞并轉移到1.5 mL離心管中，離心去胰酶。使用100 μL結合緩沖液（Binding buffer）重懸細胞，加入5 μL的FITC-Annexin Ⅴ和5 μL的PI，避光室溫條件下反應15 min后，每個樣品加入400 μL的Binding buffer，在流式細胞儀上檢測各組的凋亡細胞情況。

2.4 黃芪甲苷對細胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3、ANP mRNA表達的影響

按“2.2”項下方法饑餓處理細胞后分組給藥，培養24 h后收集細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA，然后利用特異性引物進行擴增。反應體系：2×qPCR SYBR Green Master Mix緩沖液 5 μL，2 μmol/L的上、下游引物各1 μL，cDNA模板3 μL，總體積為10 μL。反應條件：94 ℃預變性 4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；然后以72 ℃延伸5 min結束反應。擴增結束后以GAPDH為內參，采用Quante Studio Soft 1.3軟件通過2ΔΔct法進行相對定量分析。引物序列和產物長度見表1。

2.5 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 細胞的培養和鑒定結果

倒置相差顯微鏡觀察結果顯示，剛分離接種到培養板中的心肌細胞大多為圓形，偶見少數其他不規則形狀；培養4 h后，細胞逐漸呈現貼壁狀態，偶見扁平形、三角形及少數長梭形；培養24 h后，細胞基本貼壁，多呈圓形、梭形和三角形，貼壁的單個細胞出現自發性搏動，搏動頻率和節律還未同步。免疫組化結果顯示，培養的心肌細胞純度在95%以上。原代培養心肌細胞的鑒定圖見圖1。

3.2 細胞活性測定結果

與正常對照組比較，D-gal組細胞的活性顯著降低（P<0.01）；與D-gal組比較，黃芪甲苷低、中、高質量濃度組細胞的活性均顯著升高（P<0.01），且具有一定的濃度依賴性。正常對照組、D-gal組和黃芪甲苷低、中、高質量濃度組的細胞活性分別為100%、（44.75±3.50）%、（58.51±4.54）%、（65.44±3.13）%、（71.88±3.70）%（n=6）。

3.3 細胞凋亡測定結果

3.3.1 Hoechst 33342染色結果 正常對照組細胞呈均一的核染，且未見異常核；D-gal組細胞呈典型凋亡狀態，鏡下可見染色質濃集、核固縮、核碎裂等多種凋亡形態學特征，且貼壁細胞數量減少明顯；黃芪甲苷低濃度組細胞可見少數的核固縮、核碎裂，但貼壁細胞數量較D-gal組多；黃芪甲苷中濃度組核固縮、核碎裂的細胞數顯著減少；黃芪甲苷高濃度組細胞狀態與正常對照組細胞接近，并且貼壁細胞數較D-gal組明顯多。各組細胞凋亡檢測的Hoechst 33342染色圖見圖2。

3.3.2 流式細胞術測定結果 與正常對照組比較，D-gal組的細胞凋亡率顯著升高（P<0.01）；與D-gal組比較，黃芪甲苷低、中、高質量濃度組的細胞凋亡率均顯著降低（P<0.01），且具有一定的濃度依賴性。各組細胞凋亡率測定的流式圖見圖3，測定結果見表2。

3.4 細胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3、ANP mRNA表達水平測定結果

與正常對照組比較，D-gal組細胞中Bcl-2 mRNA的表達水平和Bcl-2/Bax比值顯著降低（P<0.05），Bax、Caspase-3、ANP mRNA的表達水平顯著升高（P<0.05）；與D-gal組比較，黃芪甲苷低、中、高質量濃度組細胞中Bcl-2 mRNA的表達水平和Bcl-2/Bax比值均顯著升高（P<0.05），Bax、Caspase-3、ANP mRNA的表達水平均顯著降低（P<0.05）。各組細胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3和ANP mRNA表達水平測定結果見表3。

4 討論

D-gal是一種常用的衰老誘導劑，在篩選與衰老相關的致病靶點和相關藥物的研究中應用廣泛，D-gal誘導的體內外衰老表型主要與氧化應激、自噬或凋亡相關的細胞損傷及與線粒體功能障礙相關的代謝異常有關[7]。在D-gal誘導的衰老過程中涉及Caspase-3依賴的凋亡途徑。研究顯示，活化的Caspase-3能夠裂解很多底物蛋白（如PARP），被裂解的PARP失去固有生物活性的同時損傷細胞核內的DNA，從而引發細胞凋亡[8]。在本研究中，D-gal組細胞中Caspase-3 mRNA的表達水平顯著升高，而給予黃芪甲苷后細胞中Caspase-3 mRNA的表達水平顯著降低，提示這是黃芪甲苷抑制D-gal誘導的心肌細胞凋亡的作用機制之一。

ANP是一種由心房合成、貯存和分泌的活性多肽，具有強大的利鈉、利尿、舒張血管、降低血壓、對抗腎素-血管緊張素系統和抗利尿激素等作用，當心臟壓力負荷和容量負荷增加時，心房會反射性地合成和分泌ANP，以減輕心臟負荷和改善心功能[9-10]。因此，ANP常作為判斷心功能是否受損的標志。在本研究中，與正常對照組細胞比較，D-gal能夠提高細胞中ANP mRNA的表達水平，而給予不同濃度黃芪甲苷后細胞中ANP mRNA的表達水平均顯著降低，這提示黃芪甲苷對D-gal所致的細胞損傷具有較好的保護作用。

有研究顯示，細胞或機體在應激條件下自噬過程的活化在一定程度上會減少或抑制凋亡過程，如敲除或敲低與自噬過程相關的基因ATG后通常會導致細胞凋亡或壞死[11-12] 。Bcl-2是一類抗凋亡蛋白，其通過結合或抑制自噬調節蛋白Beclin1的活性而對自噬過程發揮間接的負調節作用[13]。相反，Bcl-2家族成員Bax是一種促凋亡因子，其能夠通過Caspase通路裂解自噬調節蛋白Beclin1而阻止自噬過程的發生[14]。因此，Bcl-2和Bax表達水平的比值能夠反映細胞凋亡和自噬水平。在本研究中，D-gal組細胞中Bcl-2/Bax比值顯著降低，說明細胞的凋亡水平較高；給予黃芪甲苷后細胞中Bcl-2/Bax比值顯著升高，說明細胞中具有抑制凋亡作用的Bcl-2水平增加，而具有促凋亡作用的Bax水平降低，該結果在相應的Hoechst熒光染色和流式細胞儀凋亡分析中也得到了驗證。

綜上所述，黃芪甲苷對D-gal誘導的原代心肌細胞凋亡有一定的保護作用，其機制可能與抑制ANP、Caspase-3 mRNA的表達和提高Bcl-2/Bax的比值有關，但其更多的作用機制尚需進一步研究。

參考文獻

[ 1 ] LEEHEY DJ， CASINI T， MASSEY D. Remission of me- mbranous nephropathy after therapy with Astragalus membranaceus[J]. Am J Kidney Dis，2010，55（4）：1028-1032.

[ 2 ] ZHANG ZC， LI SJ， YANG YZ， et al. Effect of astragaloside on cardiomyocyte apoptosis in murine coxsackievirus B3 myocarditis[J]. J Asian Nat Prod Res，2007，9（2）：145-151.

[ 3 ] CLANCY RM， NEUFING PJ， ZHENG P， et al. Impaired clearance of apoptotic cardiocytes is linked to anti-SSA/Ro and -SSB/La antibodies in the pathogenesis of congenital heart block[J]. J Clin Invest，2006，116（9）：2413-2422.

[ 4 ] UMOH NA， WALKER RK， AL-RUBAIEE M， et al. Ac- ute alcohol modulates cardiac function as PI3K/Akt regulates oxidative stress[J]. Alcohol Clin Exp Res，2014，38（7）：1847-1864.

[ 5 ] BRISTON SJ， DIBB KM， SOLARO RJ， et al. Balanced changes in Ca buffering by SERCA and troponin contribute to Ca handling during β-adrenergic stimulation in cardiac myocytes[J]. Cardiovasc Res，2014，104（2）：347- 354.

[ 6 ] LIU J， WANG J， CHEN X， et al. Ginkgo biloba extract EGB761 protects against aging-associated diastolic dysfunction in cardiomyocytes of D-galactose-induced aging rat[J]. Oxid Med Cell Longev，2012.DOI：10.1155/2012/418748.

[ 7 ] DU Z， YANG Q， LIU L， et al. NADPH oxidase 2-dependent oxidative stress， mitochondrial damage and apoptosis in the ventral cochlear nucleus of D-galactose-induced aging rats[J]. Neuroscience，2015.DOI：10.1016/j.neuroscience.2014.11.061.

[ 8 ] YANG W， SHI L， CHEN L， et al. Protective effects of perindopril on D-galactose and aluminum trichloride induced neurotoxicity via the apoptosis of mitochondria-mediated intrinsic pathway in the hippocampus of mice[J]. Brain Res Bull， 2014.DOI：10.1016/j.brainresbull.2014. 09.010.

[ 9 ] 童洋飛，郭奉潔，潘夕春，等.雷公藤甲素對大鼠心肌H9c2細胞肥大的抑制作用[J].中國藥房，2015，26（7）：878-881.

[10] 張永娜，趙秀莉，陳秀英，等.黃芪注射液對鹽水負荷模型大鼠的利尿作用研究[J].中國藥房，2015，26（10）：1366-1368.

[11] ZHANG SF， WANG XL， YANG XQ， et al.Autophagy- associated targeting pathways of natural products during cancer treatment[J]. Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（24）：10557-10563.

[12] LUM JJ， BAUER DE， KONG M， et al. Growth factor regulation of autophagy and cell survival in the absence of apoptosis[J]. Cell，2005，120（2）：237-248.

[13] PATTINGRE S， TASSA A， QU X， et al. Bcl-2 antiapoptotic proteins inhibit Beclin 1-dependent autophagy[J]. Cell，2005，122（6）：927-939.

[14] LUO S， GARCIA-ARENCIBIA M， ZHAO R， et al. Bim inhibits autophagy by recruiting Beclin 1 to microtubules[J]. Mol Cell，2012，47（3）：359-370.

（收稿日期：2017-10-23 修回日期：2018-02-28）

（編輯：林 靜）