馬歸液對腺性膀胱炎模型大鼠TGF—β1、EGF—β的影響

蔡蔚 謝海平 龍蠡 謝曉 楊華偉

〔摘要〕 目的 研究馬歸液對腺性膀胱炎模型大鼠轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、表皮生長因子-β（epidermal growth factor-β， EGF-β）的影響機制。方法 采用膀胱灌注DH5？琢大腸桿菌溶液的方法建立腺性膀胱炎大鼠模型，將模型大鼠分為模型組（灌注生理鹽水，1周1次）、馬歸液1組（灌注馬歸液，1周1次）、馬歸液2組（灌注馬歸液，1周2次）、吡柔比星組（灌注吡柔比星，1周1次），連續干預8周后對大鼠膀胱進行病理學檢查，免疫組化法檢測TGF-β1、EGF-β的表達。結果 病理學顯示馬歸液1組和馬歸液2組大鼠的膀胱黏膜恢復正常。與模型組比較，吡柔比星組、馬歸液1組和馬歸液2組TGF-β1、EGF-β的平均吸光度值、蛋白表達明顯升高（P<0.01）。與吡柔比星組比較，馬歸液1組TGF-β1平均吸光度值、蛋白表達降低、EGF-β平均吸光度值、蛋白表達與吡柔比星組相近，差異均無統計學意義（P>0.05）；與吡柔比星組比較，馬歸液2組TGF-β1平均吸光度值、蛋白表達與吡柔比星組相近，差異無統計學意義（P>0.05），但馬歸液2組EGF-β平均吸光度值、蛋白表達高于吡柔比星組，差異有統計學意義（P<0.01或P<0.05）。與馬歸液1組比較，馬歸液2組TGF-β1、EGF-β的平均吸光度值、蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。結論 馬歸液能促進腺性膀胱炎大鼠膀胱炎性組織的修復，其機制可能與馬歸液對TGF-β1、EGF-β的調控作用有關。

〔關鍵詞〕 馬歸液；腺性膀胱炎；轉化生長因子β1；表皮生長因子β

〔中圖分類號〕R285.5；R256.52 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.08.007

〔Abstract〕 Objective To study the mechanism of the effect of Magui Liquid on the expression of transforming growth factor-β1（TGF-β1） and epidermal growth factor-β （EGF-β） in a rat model of glandular cystitis. Methods A rat model of glandular cystitis was established by bladder infusion with Escherichia coli strain DH5α solution. The rats were divided into model group （infusion with saline once a week）， Magui Liquid 1 group （infusion with Magui Liquid once a week）， Magui Liquid 2 group （infusion with Magui Liquid twice a week）， and pirarubicin group （infusion with pirarubicin once a week）. The rats received pathological examinations after 8 continouse weeks of drug intervention. Immunohistochemistry was used to measure the expression of TGF-β1 and EGF-β. Results Pathological examinations showed that the bladder mucosa returned to normal in the Magui Liquid groups. The pirarubicin group and the Magui Liquid groups had significantly higher mean absorbance and expression levels of EGF-β and TGF-β1 than the model group （P<0.01）. There were no significant differences in mean absorbance or expression levels of EGF-β or TGF-β1 between the pirarubicin group and the Magui Liquid 1 group （P>0.05）. There were also no significant differences in mean absorbance or expression level of TGF-β1 between the pirarubicin group and the Magui Liquid 2 group （P>0.05）. However， the Magui Liquid 2 group had significantly higher mean absorbance and expression level of EGF-βthan the pirarubicin group （P<0.01）. The Magui Liquid 2 group had significantly higher mean absorbance and expression levels of EGF-β and TGF-β1 than the Magui Liquid 1group （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion Magui Liquid can promote the repair of the inflammatory tissue in rats with glandular cystitis， probably by regulation of TGF-β1 and EGF-β.

〔Keywords〕 Magui Liquid； glandular cystitis； transforming growth factor-β1； epidermal growth factor-β

腺性膀胱炎是膀胱黏膜增生性病變，多伴有非特異性感染，與膀胱癌有著密切聯系[1]。有學者[2]認為腺性膀胱炎是膀胱癌的潛在癌前病變。目前腺性膀胱炎的治療多為膀胱黏膜電切聯合化療藥物膀胱灌注，但術后易復發，且膀胱灌注也易出現膀胱刺激征，患者難以耐受。近年來，本課題組臨床使用馬歸液膀胱灌注治療腺性膀胱炎取得了較好的效果[3]。本研究以腺性膀胱炎大鼠模型為研究對象，觀察自制馬歸液對腺性膀胱炎的作用機制，現報道如下。

1 材料

1.1 實驗動物

成年雌性SD大鼠62只，體質量（220±10）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK（湘）2011-0003，于湖南中醫藥大學SPF級動物實驗中心喂養。所有動物均給予自由飲水，普食喂養，適應飼養1周。

1.2 藥物

吡柔比星藥液制備：吡柔比星凍干粉針劑30 mg，加注射用水配成50 mL溶液備用（吡柔比星，10 mg/支，深圳萬樂藥業有限公司生產，批號：1505c4）。馬歸液：由馬鞭草30 g，當歸20 g，赤芍20 g，生黃芪20 g四味藥物制備而成，以上飲片均由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科制劑中心提供，經湖南中醫藥大學中藥學教研室鑒定符合藥典規定。大腸埃希菌溶液（濃度在108～109 CFU/100 ？滋L）由湖南中醫藥大學第一附屬醫院檢驗科微生物室提供。25%烏拉坦溶液，由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.3 特殊藥品制作

大腸埃希菌溶液的制備：在無菌條件下，從-70 ℃冰箱取出DH5α大腸埃希菌菌種，挑起菌種接種在裝有5 mL LB培養基的無菌離心試管中，置于37 ℃恒溫搖床，轉速150 r/min。10 h后，用分光光度儀測定大腸桿菌的濃度，大腸埃希菌溶液的濃度應保持在108～109 CFU/100 ？滋L。馬歸液的制備：將當歸冷浸0.5 h，用水蒸氣蒸餾提取揮發油，蒸餾后的水溶液另器保存，藥渣與馬鞭草、赤芍、黃芪加水煎煮3次，加水量分別為藥材量的10倍、8倍、8倍，第1次煎煮2 h，第2、3次各煎煮1.5 h，合并煎液，濾過，濾液與上述水溶液合并，靜置24 h，濾過，濃縮至近50 mL、藥物濃度為1.8 g/mL，加入適量防腐劑與當歸揮發油，調整總容量至50 mL，攪勻，灌封，滅菌，即得。

1.4 試劑與主要儀器

SABC試劑盒，TGF-？茁1抗體（批號：11A24），EGF-？茁抗體（批號：BA0049），均購自武漢博士德生物公司。pv-9000二步法免疫組化檢測試劑盒（購自北京中杉金橋公司，批號201502）。LEICA DM LB2型雙目顯微鏡（德國LEICA公司）；S2-93自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；KD2258型石蠟切片機（浙江金華科迪儀器設備有限公司）；DNP-9162 型電熱恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）；Motic B5 顯微攝像系統（麥克奧迪實業集團公司）；OLYMPUS BX43型雙目生物攝像顯微鏡、H-600型透射電子顯微鏡（日本）。

2 方法

2.1 腺性膀胱炎大鼠造模方法[4-5]

將成年雌性SD大鼠62只，完全隨機分為3組：空白組（10只）、生理鹽水灌注組（10只）和造模組（42只）。造模組：膀胱灌注DH5α大腸桿菌溶液（108～109 CFU/100 ？滋L）0.2 mL，隔日1次，共20次；生理鹽水灌注組：膀胱灌注生理鹽水，隔日1次，共20次；空白組：不行膀胱灌注。用25%烏拉坦按1.0 g/kg劑量腹腔注射麻醉SD大鼠，仰臥固定大鼠，常規消毒會陰部。將無菌硬膜外導管用無菌液體石蠟潤滑后，提起尿道外口的皮膚，沿尿道后壁插入尿道1 cm左右。通過抽吸導管排除大鼠殘余尿液，分別用1 mL注射器向大鼠膀胱注入0.2 mL無菌生理鹽水、大腸桿菌溶液，然后退出導管，將大鼠放入鼠籠等待自然蘇醒。50 d后每組隨機選取大鼠2只，處死取出膀胱，行H-600型透射電子顯微鏡超微病理學檢測，造模組大鼠膀胱黏膜固有層出現炎性浸潤、Brunn巢、囊腔，證實造模成功。

2.2 分組與給藥

（1）分組方法：將造模組造模成功的40只大鼠完全隨機分成4組：模型組、馬歸液1組、馬歸液2組、吡柔比星組。模型組：每周一膀胱灌注生理鹽水0.2 mL；馬歸液1組：每周一膀胱灌注馬歸液0.2 mL；馬歸液2組：每周一、周五各膀胱灌注1次馬歸液0.2 mL；吡柔比星組：每周一膀胱灌注吡柔比星注射液0.2 mL。每組均干預8周。（2）操作方法：用25%烏拉坦按1.0 g/kg劑量腹腔注射麻醉大鼠后，將無菌硬膜外導管用無菌液體石蠟潤滑，再提起尿道外口的皮膚，沿尿道后壁插入尿道1 cm。通過抽吸導管排除大鼠殘余尿液，分別用1 mL注射器向大鼠膀胱注入0.2 mL無菌生理鹽水、馬歸液、吡柔比星注射液。最后退出導管，將大鼠放入鼠籠等待自然蘇醒。

2.3 標本切取

給藥結束后將各組大鼠用25%烏拉坦溶液進行麻醉，劑量為1.0 g/kg，然后進行斷頸處死，取仰臥位，固定四肢，剪開會陰部皮膚，提起大鼠膀胱底部，分離至尿道近端剪斷，取出膀胱。

2.4 各組標本指標檢測

觀察膀胱的大體形態，迅速用10%甲醛溶液將膀胱體部和膀胱三角固定。用10%甲醛溶液將標本定型、然后流水沖洗、酒精脫水，使用二甲苯將標本進行兩次透明，然后標本浸蠟，用硬蠟將浸蠟后的標本包埋，并做好標記。對包埋好的標本修切，進而連續常規切片、展片、進行HE染色。切片做好后，分別置于100倍、200倍、400倍光學顯微鏡下觀察膀胱黏膜固有層是否有炎性細胞浸潤、腺體樣結構、囊腔和Brunn巢結構。各組大鼠膀胱免疫組化檢測嚴格參照試劑盒產品說明書進行操作，分別檢測轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、表皮生長因子-β（epidermal growth factor-β，EGF-β）的表達，采用HMIAS高清晰度醫學圖文分析系統檢測TGF-β1、EGF-β的平均吸光度值。

2.5 統計方法

所有實驗數據均以“x±s”表示，采用SPSS 21.0進行統計學處理，兩組間比較用SNK-q檢驗，多組間比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 病理切片HE染色鏡下觀察結果

模型組：可見膀胱黏膜上皮層變薄，固有層排列混亂，基底層空泡樣變，局部有炎性浸潤，血管增多，可見腺體樣結構。吡柔比星組：可見膀胱黏膜上皮層變厚，固有層排列混亂，基底層空泡樣變，血管增多，未見炎性浸潤。馬歸液1組、馬歸液2組：膀胱黏膜完好，未見壞死、炎性浸潤。見圖1。

3.2 各組大鼠TGF-β1、EGF-β的平均吸光度值比較

與模型組比較，吡柔比星組、馬歸液1組和馬歸液2組TGF-β1、EGF-β的平均吸光度值明顯升高（P<0.01）。與吡柔比星組比較，馬歸液1組TGF-β1平均吸光度值降低、EGF-β平均吸光度值與吡柔比星組相近，差異均無統計學意義（P>0.05）；與吡柔比星組比較，馬歸液2組TGF-β1平均吸光度值與吡柔比星組相近，差異無統計學意義（P>0.05），但馬歸液2組EGF-β平均吸光度值高于吡柔比星組，差異有統計學意義（P<0.05）。與馬歸液1組比較，馬歸液2組TGF-β1、EGF-β的平均吸光度值明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

3.3 各組大鼠TGF-β1、EGF-β蛋白表達比較

與模型組比較，吡柔比星組、馬歸液1組、馬歸液2組TGF-β1、EGF-β蛋白表達均升高，差異有統計學意義（P<0.01）。與吡柔比星組比較，馬歸液1組TGF-β1蛋白表達降低、EGF-β蛋白表達與吡柔比星組相近，差異均無統計學意義（P>0.05）；與吡柔比星組比較，馬歸液2組TGF-β1蛋白表達與吡柔比星組相近，差異無統計學意義（P>0.05），但馬歸液2組EGF-β蛋白表達高于吡柔比星組，差異有統計學意義（P<0.01）。與馬歸液1組比較，馬歸液2組TGF-β1、EGF-β蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01），見表2、圖2-3。

4 結論

腺性膀胱炎是一種以尿頻、尿急、恥骨上方脹痛及夜尿頻繁等為主要表現的慢性膀胱疾患，目前腺性膀胱炎的病因尚未完全明確[5]，部分研究表明腺性膀胱炎是一種少見的腫瘤炎性病變，被認為是一種癌前病變，具有演變為膀胱腺癌的傾向[6]。而非可控性炎癥是指在一些不確定因素的影響下，持續或低強度的炎癥刺激使靶組織處于長期或過度反應，炎癥無法從抗感染、修復組織損傷模式下轉變成為穩定的平衡狀態，導致炎癥反應持續進行。長期慢性的非可控性炎癥可以誘導腫瘤的發生，并在腫瘤發病進程和轉歸中起到重要作用[7-8]。非可控性炎癥感染可激活和募集大量白細胞，分泌各種細胞因子，如轉化生長因子（TGF）[9]、表皮生長因子（EGF）[10]、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）等，一起組成新的炎癥微環境，另外炎細胞也可分泌蛋白溶解酶，這些炎癥介質可在腫瘤的發生、發展過程中起重要作用，并刺激腫瘤細胞生長、血管和淋巴管生成以及腫瘤的浸潤轉移。

TGF-β1是調節細胞生長和分化的TGF-β超家族成員，能使正常的成纖維細胞的表型發生轉化，TGF-β1對正常細胞及癌變早期細胞具有抑制作用，而TGF-β1被認為是最強的致纖維化因子[11]。腺性膀胱炎的發生發展與TGF-β1具有密切關系，TGF-β1參與了膀胱形態的變化，在膀胱炎癥及纖維化的進程中也有著重要作用。近期研究發現，TGF-β1可依賴Smad2/3方式介導膀胱上皮間質轉化過程，促進纖維細胞合成膠原纖維以利于損傷區修復[12]。而EGF是人體一種很強的促有絲分裂因子，能促進組織細胞增生與分裂，增強表皮細胞的活力，加速皮膚、黏膜的創傷愈合和損傷修復，并能促進腫瘤細胞浸潤和轉移，在參與多種器官纖維化過程中起重要作用。EGF和TGF通過結合相同的表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor， EGFR）刺激細胞發生有絲分裂，在創傷修復、腫瘤發生等過程中具有重要功能[12-13]。膀胱黏膜修復和愈合需要依靠各類細胞生長因子的相互作用，其過程是極為復雜的。EGF具有刺激黏膜上皮細胞的蛋白質和DNA合成，促進上皮細胞增生，改善黏膜血循環和增強黏膜屏障，在黏膜的損傷修復過程中及維持黏膜的完整性發揮著重要作用。TGF屬于炎性細胞趨化因子，可促進炎癥細胞和成纖維細胞向傷口聚集，促進創面小血管的生成、肉芽組織生長和表皮形成。TGF-β1與EGF-β相互作用，可調控機體局部炎癥發生、發展的趨勢，促進創面的愈合。在炎癥發生發展期間，TGF-β1、EGF-β大量釋放，參與炎性組織的修復。

腺性膀胱炎屬中醫學“淋證”范疇，多由濕熱之邪下注膀胱，膀胱氣化失司，或熱結于下焦，致尿頻、尿急、小腹脹痛、尿血等諸證。根據“久病致虛、久病致瘀”理論，結合長期的臨床觀察，發現濕熱蘊結、氣虛血瘀在腺性膀胱炎中較為常見，治療應以清熱利濕、益氣活血為法[3]。本課題采用的自制中藥馬歸液具有“清熱利濕通淋、益氣活血化瘀、消腫散結抗癌”之功效，由馬鞭草、當歸、赤芍、黃芪四味中藥經先進工藝制成，諸藥合用，具有抗菌消炎、止痛止血、抗癌抗腫瘤、促進愈合等作用[3，14]。

本實驗研究結果顯示，與模型組比較，馬歸液治療后的大鼠模型TGF-β1、EGF-β平均吸光度值、蛋白表達均明顯升高（P<0.05），結合病理學結果，馬歸液治療后的腺性膀胱炎大鼠模型的膀胱黏膜恢復正常，說明馬歸液具有調節腺性膀胱炎大鼠模型TGF-β1、EGF-β蛋白表達，從而促進膀胱組織修復，提高腺性膀胱炎的愈合率的效果。馬歸液2組的TGF-β1、EGF-β蛋白表達明顯高于馬歸液1組，說明馬歸液2組療效更佳。

綜上所述，馬歸液能促進腺性膀胱炎大鼠膀胱炎性組織的修復，其機制可能與馬歸液對TGF-β1、EGF-β的調控作用有關。但是腺性膀胱炎的病理機制尚十分復雜，馬歸液對腺性膀胱炎的相關信號通路的影響還有待進一步研究。

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