UPLC—Q—TOF/MS法分析鑒定對葉百部堿在大鼠體內的代謝產物

董巍 巫秋萍 梁鑫 崔濤 潘虹

中圖分類號 R284 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）09-1218-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.09.16

摘 要 目的：分析鑒定大鼠灌胃對葉百部堿后血漿、尿液和糞便中的代謝產物，闡明對葉百部堿的代謝途徑。方法：將大鼠隨機分為空白組（0.3%羧甲基纖維素）與給藥組（灌胃給予對葉百部堿，50 mg/kg），每組6只。分別采集大鼠灌胃給藥后0.25、0.5、1、2、4、6、12 h的血漿以及給藥后0～12 h、12～24 h的尿液和糞便并制備樣品，采用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜法和Triple TOFTM高分辨率質譜自帶的軟件聯合分析、鑒定各樣品中代謝產物的化學結構。結果：從大鼠血漿中檢測到4個化合物，包括1個原型化合物和3個代謝產物，在尿液中檢測到4個代謝產物，在糞便中被檢測到2個代謝產物，且代謝產物主要為Ⅰ相的水合代謝產物和羥基化代謝產物，未檢測到Ⅱ相代謝產物。結論：對葉百部堿灌胃后在大鼠體內主要經水合、羥基化等途徑代謝。

關鍵詞 對葉百部堿；超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜法；代謝產物；鑒定

ABSTRACT OBJECTIVE： To analyze and identify the metabolites of tuberostemonine in rats plasma，urine and feces，and to clarify metabolic pathway of tuberostemonine. METHODS： Rats were randomly divided into blank group （0.3% carboxymethyl cellulose） and medication group （tuberostemonine 50 mg/kg，i.g.），with 6 rats in each group. The plasma of rats was collected 0.25，0.5，1，2，4，6，12 h after intragastric administration to prepare samples. Urine and feces were collected 0-12 h and 12-24 h after administration to prepare samples. UPLC-Q-TOF/MS and software of Triple TOFTM high resolution mass spectrometry were used to analyze and identifiy chemical structure of metabolites in samples. RESULTS： A total of 4 compounds were detected in rat plasma，including one prototype compound and 3 metabolites. 4 metabolites were detected in urine and 2 metabolites in feces. Phase Ⅰ metabolites of tuberostemonine mainly included hydration and hydroxylation. Phase Ⅱ metabolites were not found. CONCLUSIONS： Hydration and hydroxylation are the major metabolic transformation forms of tuberostemonine in rats in vivo.

KEYWORDS Tuberostemonine； UPLC-Q-TOF/MS； Metabolite； Identification

百部為我國傳統的常用中藥材，始載于《名醫別錄》，2015版《中國藥典》（一部）共收載有直立百部[Stemona sessilifolia（Miq）Miq.]、蔓生百部[Stemona japonica（BL）Miq.]和對葉百部（Stemona tuberosa Lour.）3個品種[1]。現代藥理學研究表明，百部具有鎮咳、祛痰、平喘[2]、殺蟲[3-4]、抗炎[5]和抗肺結核[6]等作用。百部屬植物中的生物堿類成分是鎮咳[7-10]、殺蟲[3，11]的主要活性成分，非生物堿類成分是抗菌的主要活性成分[12-15]，其中對葉百部堿是對葉百部主要的百部屬生物堿類成分之一，具有顯著的鎮咳活性[9]和殺蟲活性，并且未見毒性[3]，具有較好的開發應用價值。本研究擬通過收集大鼠灌胃百部新堿后的生物樣品（血漿、尿液和糞便），通過超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF/MS）技術尋找對葉百部堿在大鼠體內的代謝產物和推測代謝途徑，初步探索對葉百部提取物中的效應成分對葉百部堿在大鼠體內的代謝過程，為對葉百部堿的臨床應用以及合理解釋該化合物的作用機制提供數據支撐。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜（HPLC）儀（包括LC-30AD泵、CTO-30A柱溫箱、SIL-30AC自動進樣器、DGU-20A3脫氣機、CBM-20A控制系統）、Triple-TOFTM 4600 TOF/MS儀（美國AB SCIEX公司）；WTL-10K離心機（湖南湘儀有限公司）；KQ5200DE數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 對照品與試劑

對葉百部堿對照品（成都維克安科技有限公司，批號：6879-1-2，純度：>98%）；甲醇、乙腈為色譜純，水為蒸餾水。

1.3 動物

健康清潔級Wistar大鼠24只，♂，體質量（200±20） g，購于黑龍江中醫藥大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（黑）2008-004。

2 方法與結果

2.1 對葉百部堿混懸液的制備

稱取對葉百部堿對照品適量，置于25 mL量瓶中，加入適量0.3%羧甲基纖維素鈉溶液溶解并定容，即得。

2.2 分組與給藥

將24只大鼠隨機分為空白組和給藥組，每組12只，適應性飼養7 d后，給藥組大鼠按50 mg/kg的劑量（給藥劑量根據預實驗結果確定）灌胃給予對葉百部堿對照品（溶劑為0.3%羧甲基纖維素鈉溶液），空白組大鼠給予等體積0.3%羧甲基纖維素鈉溶液。

2.3 樣品采集及處理

2.3.1 血漿樣品 隨機取空白組和給藥組大鼠各6只，分別在給藥后0.25、0.5、1、2、4、6、12 h于眼眶后靜脈叢取血0.3 mL，置于肝素化的離心管中，在4 ℃下以離心半徑為20 cm、10 000 r/min（下同）離心10 min，取上清液，放入-20 ℃冰箱中，備用。臨用時，取各組大鼠血清0.5 mL，加入10 μL磷酸溶液渦旋60 s，上樣到經活化處理的固相萃取柱，1 mL水洗脫后棄去洗脫液，再用1 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，N2吹干后殘渣以50 μL甲醇溶解，然后以離心半徑為20 cm、10 000 r/min離心5 min，收集上清液。

2.3.2 尿液和糞便 取空白組和給藥組余下的大鼠各6只，置于代謝籠中，分別收集兩組大鼠0～12 h和12～24 h兩個時間段的尿液和糞便。尿液在4 ℃條件下離心，收集上清液，放入-20 ℃冰箱保存，備用。（1）糞便樣品的處理。臨用時，分別取兩組大鼠的干燥糞便樣品碾磨，稱取1 g碾磨粉，加入4 mL甲醇超聲（功率：150 W）提取30 min，離心，收集上清液，上清液經0.22 μm微孔濾膜濾過，收集濾液。（2）尿液樣品的處理。取兩組大鼠尿液用蒸餾水稀釋5倍，然后加入甲醇適量，離心，收集上清液，將上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過，收集濾液。

2.4 色譜與質譜條件

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：水（A）-乙腈（含0.1%甲酸，B）（100 ∶ 0.1，V/V），梯度洗脫（0～2 min，99%～90%A；2～5 min，90%A；5～15 min，90%～85%A）；柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL/min；進樣量：3 μL。

2.4.2 MS條件 電噴霧離子源（ESI源），正離子模式檢測；離子噴霧電壓為5 500 V，離子源溫度為500 ℃；霧化氣體為N2，霧化氣（GAS 1，N2）為50 psi，輔助加熱氣（GAS 2，N2）為50 psi，氣簾氣（Cur，N2）為35 psi；解簇電壓（DP）為100 V；碰撞能為35 eV。掃描范圍質荷比（m/z）為50～1 000，IDA設置響應值超過100 cps的8個最高峰進行二級MS掃描。

2.5 對葉百部堿的MS裂解規律分析

取對葉百部減對照品溶液3 μL，按照“2.4”項下條件進樣分析，結果見圖1。

由圖1可見，低碰撞能量MS圖中給出準分子離子峰[M+H]+為m/z 376.249 6，保留時間為10.45 min；高碰撞能量MS圖中主要碎片離子m/z為376.248 7、302.212 6、276.196 3等。對葉百部堿屬于典型的百部屬stenine Ⅰ型生物堿結構，其典型的裂解方式因含有α-甲基-γ-內酯環，除能生成脫內酯環離子[M-100]+外，還能得到與其相應的特征離子[M-74]+的特征性碎片離子[16]。由于大多數代謝產物仍保留原型的基本骨架結構或亞結構，因此以上對葉百部堿的MS裂解規律將為其代謝產物結構鑒定提供重要參考依據。

2.6 大鼠血漿、尿液、糞便樣品的UPLC-Q-TOF/MS分析

2.6.1 取“2.3”項下樣品經UPLC色譜分離，利用Analyst TF 1.7.1軟件的PeakView 2.2和Formula-finder、XIC Manager等數據處理功能，經過峰提取和解析，根據血漿、尿液、糞便樣品的一級MS和二級MS掃描信息，并與空白血漿、尿液、糞便對比尋找潛在的代謝產物。結果，在血漿樣品中共檢測到4個化合物，包括1個原型和3個代謝產物，在尿液中檢測到4個代謝產物，在糞便中被檢測到2個代謝產物，不同樣品的提取離子流圖見圖2。

2.6.2 化合物的結構解析 （1）M0：一級MS圖中顯示準分子離子峰[M+H]+為m/z 376.248 2，保留時間為10.41 min，僅在大鼠血漿樣品中檢測到，其MS、二級MS和保留時間與對葉百部堿對照品基本一致，故推測M0為對葉百部堿原型藥物。（2）M1～M2：在一級色譜圖m/z為392.243 7的提取離子流色譜圖中，可以檢測到 2個色譜峰，保留時間分別為8.85、9.02 min。比對葉百部堿[M+H]+多16 Da，其二級MS的主要特征碎片為m/z 376.229 3、376.252 7、302.208 4、302.212 6，與對葉百部堿碎片基本一樣，所以推測M1、M2為對葉百部堿的羥基化產物，羥基化的位置可能發生在α-甲基-γ-內酯環。由于對葉百部堿結構中存在2個α-甲基-γ-內酯環，現有M1、M2的MS信息只能觀察到離子豐度略有不同，無法判斷M1、M2的具體結合位點。M3～M4：在一級色譜圖m/z為394.259 8的提取離子流色譜圖中，可以檢測到 2個色譜峰，保留時間分別為9.43、9.81 min，比對葉百部堿[M+H]+多18 Da；其二級MS的主要特征碎片為m/z 376.239 5、376.247 4、302.208 3、302.209 5等，與對葉百部堿碎片基本一樣，所以推測M3、M4為對葉百部堿的水合產物，水合的位置可能發生在α-甲基-γ-內酯環。但現有M3、M4的MS信息只能觀察到離子豐度略有不同，無法判斷M3、M4的具體結合位點。對葉百部堿代謝產物的二級MS圖見圖3，色譜、MS信息和代謝途徑分析見表1，推測的代謝途徑示意圖見圖4。

3 討論

UPLC-Q-TOF/MS不僅具有分析速度快、選擇性強、準確度好、靈敏度高的特點，而且能提供豐富的碎片離子信息和二級MS信息，精確鑒定代謝產物，已廣泛用于生物樣品的體內代謝研究中[17-19]。根據對葉百部堿的性質，本研究選擇在流動相中加入0.1%甲酸，得到的色譜峰峰形較好且響應值高。筆者前期考察了正、負離子模式掃描，發現正離子模式掃描下百部屬生物堿類成分響應較好；同時優化了洗脫梯度，使樣品在15 min內即可以完成檢測。

本研究在優化色譜和MS條件后，系統研究對葉百部堿經灌胃給藥后在大鼠血漿、尿液和糞便中的代謝情況。結果，在大鼠血漿中檢測到4個化合物，包括1個原型和3個代謝產物，在尿液檢測到4個代謝產物，在糞便中檢測到2個代謝產物。在代謝物的鑒定中，對葉百部堿的原型僅在血漿樣品中檢測到，推測可能是由于含量低，或者該成分響應較低，所以在其他兩個樣品中沒有檢測到。本研究結果表明，對葉百部堿的Ⅰ相代謝產物較多，在大鼠體內的代謝途徑為水合、羥基化，沒有發現Ⅱ相代謝產物。

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（收稿日期：2017-10-19 修回日期：2018-03-19）

（編輯：林 靜）