無梗五加果實3種提取物對人肝癌細胞SMMC—7721增殖和凋亡的影響

劉玉強 管美玉 孫建之 才謙

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）09-1252-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.09.24

摘 要 目的：研究無梗五加果實3種提取物對人肝癌細胞SMMC-7721增殖、細胞周期和凋亡的影響，為明確其抗腫瘤作用機制提供參考。方法：采用MTT法考察低、中、高質量濃度的無梗五加果實乙醇提取物（0.92、1.84、3.68 mg/mL）、粗多糖提取物（0.06、0.12、0.24 mg/mL）和精多糖提取物（0.04、0.08、0.16 mg/mL）分別作用24、36、48 h后對人肝癌細胞SMMC-7721的增殖抑制作用；采用流式細胞術考察1.84 mg/mL乙醇提取物、0.24 mg/mL粗多糖提取物和0.16 mg/mL精多糖提取物分別作用24 h后對人肝癌細胞SMMC-7721細胞周期和細胞凋亡的影響。以上試驗均設陰性對照（只加細胞不加藥物）。結果：與陰性對照比較，無梗五加果實3種提取物均可顯著抑制人肝癌細胞SMMC-7721的增殖（P<0.01），顯著降低G0/G1、G2/M期細胞的百分率（P<0.01），顯著升高S期細胞的百分率（P<0.01），顯著升高細胞凋亡率（P<0.05），其中以無梗五加果實乙醇提取物的作用最為明顯。結論：無梗五加果實3種提取物均能抑制人肝癌細胞SMMC-7721的增殖，阻滯其細胞周期于S期，誘導其凋亡。

關鍵詞 無梗五加果實；乙醇提取物；粗多糖提取物；精多糖提取物；人肝癌細胞SMMC-7721；增殖；凋亡

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of 3 extracts of Acanthopanax sessiliflorus fruits on the proliferation and apoptosis of human hepatocarcinoma cells SMMC-7721， and to provide reference for confirming the mechanism of anti-tumor effect. METHODS： MTT assay was adopted to investigate the effects of low-mass concentration， medium-mass concentration and high-mass concentration of ethanol extract （0.92， 1.84， 3.68 mg/mL）， crude polysaccharide extract （0.06， 0.12， 0.24 mg/mL） and refined polysaccharide extract （0.04， 0.08， 0.16 mg/mL） from A. sessiliflorus fruits on the proliferation and apoptosis of SMMC-7721 cells after treated for 24， 36， 48 h， respectively. Flow cytometry was used to investigate the effects of 1.84 mg/mL ethanol extract， 0.24 mg/mL crude polysaccharide extract and 0.16 mg/mL refined polysaccharide extract on cell cycle and cell apoptosis after treated for 24 h. The above tests were all negative control （only adding cells without drugs）. RESULTS： Compared with negative control， 3 extracts of A. sessiliflorus fruits could significantly inhibit the proliferation of SMMC-7721 cells （P<0.01）， could significantly decrease the percentage of SMMC-7721 cells in G0/G1 and G2/M phase （P<0.01）， could significantly increase the percentage of SMMC-7721 cells in S phase （P<0.01） and the apoptosis rate of SMMC-7721 cells （P<0.05）； especially the effects of ethanol extract from A. sessiliflorus fruits were the most obvious. CONCLUSIONS： Three extracts of A. sessiliflorus fruits can inhibit the proliferation of human hepatocarcinoma SMMC-7721 cells， block SMMC-7721 cells in S phase and induce the apoptosis of SMMC-7721 cells.

KEYWORDS Acanthopanax sessiliflorus fruits； Ethanol extract； Crude polysaccharide extract； Refined polysaccharide extract； Human hepatocarcinoma cells SMMC-7721； Proliferation； Apoptosis

無梗五加[Acanthopanax sessiliflorus（Rupr.et Maxim.）Seem]為五加科五加屬一種重要的藥用植物，主產(chǎn)于東北、河北、朝鮮等地[1]，其果實具有補肝腎、強筋骨的功效，主治肝腎虧虛、小兒行遲和筋骨痿軟等癥[2-3]，臨床上主要用無梗五加制劑治療白細胞減少癥和脾腎陽虛型眩暈癥[4]。另有報道稱，無梗五加果實中多糖成分具有免疫調節(jié)、抗腫瘤的藥理作用[5]。在本研究中，筆者擬采用MTT法考察無梗五加果實乙醇提取物、粗多糖提取物和精多糖提取物在不同給藥時間、不同濃度下對人肝癌細胞SMMC-7721的增殖抑制作用，確定最佳作用時間和最佳給藥濃度。并在此基礎上，進一步研究無梗五加果實3種提取物對人肝癌細胞SMMC-7721細胞周期和凋亡的影響，從而明確其體外抑瘤作用機制。

1 材料

1.1 儀器

SUNRISE 酶標儀（瑞士Tecan公司）；FACE Vantage SE 流式細胞儀（美國BD公司）；AE31倒置相差顯微鏡（德國Motic公司）；冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；FA1004電子天平（上海越平科學儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑

無梗五加果實購自遼寧省丹東農業(yè)科學院，由遼寧中醫(yī)藥大學藥用植物教研室王冰教授鑒定為Acanthopanax sessiliflorus（Rupr.et Maxim.）Seem的干燥果實；細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒（凱基生物技術有限公司，批號：KGA108）；MTT（美國Sigma公司）；胰蛋白酶、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；其他試劑均為分析純，細胞試驗用水為三級純化水。

1.3 細胞

人肝癌細胞株 SMMC-7721購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院。

2 方法

2.1 無梗五加果實3種提取物對人肝癌細胞SMMC- 7721細胞增殖的影響

2.1.1 無梗五加果實3種提取物的制備 （1）乙醇提取物的制備。取無梗五加果實粗粉1 kg，石油醚回流提取3次，每次2 h，藥渣晾干，加80%乙醇回流提取3次，每次2 h，濾過，合并提取液，濃縮，干燥得無梗五加果實乙醇提取物178.2 g，得率為17.82%。（2）粗多糖的制備。取無梗五加果實粗粉1 kg，用8倍量水提取3次，每次2 h，濾過，濾液減壓濃縮后，加入95%乙醇使含醇量達到50%，靜置24 h，將沉淀冷凍干燥，得粗多糖提取物12.1 g，得率為1.21%。（3）精多糖的制備。取無梗五加果實粗粉1 kg，按照上述粗多糖的制備方法制備得到粗多糖，再將粗多糖提取物用水溶解制成一定濃度的溶液，采用Sevage法進行脫蛋白（Sevage試劑中氯仿和正丁醇的比例為3 ∶ 1，粗多糖溶液和Sevage試劑的比例為4 ∶ 1，混合振搖，以達到除去蛋白的目的）[6]，將除去蛋白的多糖溶液進行減壓濃縮，冷凍干燥，得精多糖提取物8.0 g，得率為0.8%。

2.1.2 給藥溶液的制備 根據(jù)各提取物收率的不同，按生藥量均為5、10、20 mg/mL將3種提取物分別制備成不同質量濃度的藥液：其中乙醇提取物給藥濃度分別為0.92、1.84、3.68 mg/mL，粗多糖的給藥濃度分別為0.06、0.12、0.24 mg/mL，精多糖的給藥濃度分別為0.04、0.08、0.16 mg/mL，微孔濾膜過濾，備用。

2.1.3 細胞培養(yǎng) 按照常規(guī)貼壁細胞的培養(yǎng)方法將人肝癌細胞SMMC-7721接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在溫度為37 ℃、5%CO2、飽和濕度的條件下進行培養(yǎng)，隔天換液并傳代1次，選取對數(shù)生長期的細胞用于研究。

2.1.4 MTT法檢測 選取培養(yǎng)了2～3 d、處于對數(shù)生長期并且生長狀態(tài)良好的人肝癌細胞SMMC-7721，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗1～2次，再用0.25% 的胰酶進行消化傳代，等到細胞狀態(tài)趨于變圓的時候，使用培養(yǎng)液清洗，然后吹打細胞將其制成細胞懸液。采用細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)，用RPMI 1640培養(yǎng)液將細胞稀釋至5×104 個/mL的密度，然后接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，將其置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)進行培養(yǎng)12 h，待細胞貼壁完全后，進行試驗分組。試驗分為3種提取物的不同質量濃度的給藥組（濃度設置見“2.1.2”項下）、陰性對照組（加細胞，但不加藥液）和空白調零組（只加培養(yǎng)液，供酶標儀調零用） ，每組設立5個復孔，將細胞置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)24、36、48 h后，分別在避光條件下每孔加入20 μL（5 mg/mL）MTT溶液，再次將細胞置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)進行培養(yǎng)4 h，吸凈孔內上清液，然后每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），等到紫色的結晶充分溶解后，使用酶標儀在492 nm波長處進行掃描[1]，測定光密度（OD）值，計算無梗五加果實各提取物對人肝癌細胞SMMC-7721的增殖抑制率[6-8]：細胞增殖抑制率（%）=（1-給藥組平均OD值/陰性對照組平均OD值）×100%。

2.2 無梗五加果實3種提取物對人肝癌細胞SMMC- 7721細胞周期和凋亡的影響

2.2.1 無梗五加果實3種提取物給藥溶液的制備 根據(jù)前期MTT試驗確定的各提取物抑制人肝癌細胞SMMC-7721細胞增殖的最佳濃度，將無梗五加乙醇提取物、粗多糖、精多糖分別加水溶解制備成質量濃度分別為1.84、0.24、0.16 mg/mL的溶液，微孔濾膜過濾，備用。

2.2.2 無梗五加果實3種提取物對人肝癌細胞SMMC- 7721細胞周期的影響 取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的人肝癌細胞SMMC-7721，用0.25%的胰酶消化，用滴管吹打至單細胞懸液，調整細胞密度為1×105個/mL，接種于6 孔板中，每孔1 mL。將試驗分為無梗五加果實乙醇提取物組（1.84 mg/mL）、粗多糖組（0.24 mg/mL）、精多糖組（0.16 mg/mL）和陰性對照組，將細胞置于37 ℃、5%CO2的飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，給藥組每孔分別給予無梗五加果實各提取物1 mL，陰性對照組每孔加入1 mL細胞培養(yǎng)液，每組設3個復孔。將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2的飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集細胞，制備單細胞懸液，以802×g 離心5 min，用預冷的PBS洗滌細胞2次，然后以離心半徑為5 cm、3 000 r/min 離心5 min，去上清，加入400 μL 的碘化丙啶（PI），混勻，4 ℃避光反應30 min，采用流式細胞儀檢測488 nm波長處的紅色熒光，ModFit細胞周期擬和軟件進行分析。

2.2.3 無梗五加果實3種提取物對人肝癌細胞SMMC-7721細胞凋亡的影響 取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的人肝癌細胞SMMC-7721，按“2.2.2”項下方法進行消化、接種、給藥、培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，收集細胞及相應的細胞上清液，用PBS洗滌細胞2次，802×g離心5 min，去上清，加入熒光素FITC標記的膜聯(lián)蛋白Ⅴ（FITC-Annexin Ⅴ）5 μL，混勻，再加入PI染液5 μL，混勻，室溫避光反應5～15 min，1 h內進行流式細胞儀檢測，采用Cell Quest 軟件分析細胞凋亡情況[9-14]。

2.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，采用單因素方差分析和t檢驗進行組間比較。 P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 細胞增殖抑制率測定結果

無梗五加果實3種提取物對人肝癌細胞SMMC- 7721細胞的增殖均有一定抑制作用。與陰性對照組比較，在給藥24、48 h后各給藥組細胞的OD值均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且乙醇提取物中濃度組和精多糖高濃度組細胞在培養(yǎng)36 h后的OD值顯著降低（P<0.05）。比較各給藥組細胞在給藥24、36、48 h后結果可知，在給藥48 h 后3種提取物對細胞增殖的抑制作用最強。粗多糖和精多糖的給藥濃度越高，抑制作者用越強，存在一定的量效關系；而乙醇提取物對細胞的增殖抑制作用則不存在量效關系，中濃度給藥時抑制作用最強，結果見表1。

3.2 細胞周期測定結果

與陰性對照組比較，乙醇提取物組、粗多糖組和精多糖組G0/G1、G2/M期細胞百分率顯著降低（P<0.01），S期細胞百分率顯著增加（P<0.01），其中乙醇提取物的作用效果優(yōu)于粗多糖和精多糖。細胞周期檢測的流式圖見圖1，測定結果見表2。

3.3 細胞凋亡率測定結果

與陰性對照組比較，乙醇提取物組、粗多糖組和精多糖組細胞的凋亡率均顯著升高（P<0.05），其中以乙醇提取物組細胞凋亡率最高。陰性對照組、乙醇提取物組、粗多糖組和精多糖組細胞總凋亡率分別為5.6%、50.2%、17.9%、20.8%，細胞凋亡檢測的流式圖見圖2。

4 討論

本研究首先采用MTT法檢測無梗五加果實乙醇提取物、粗多糖和精多糖的抗腫瘤活性，分別設立24、36和48 h這3個給藥時間，每種提取物設立高、中、低3個給藥濃度，通過對給藥時間和給藥濃度進行篩選，發(fā)現(xiàn)乙醇提取物、粗多糖提取物和精多糖提取物均在48 h后藥效最強。在給藥劑量方面，發(fā)現(xiàn)粗多糖提取物和精多糖提取物都是在高濃度時藥效最強，而乙醇提取物則是在中濃度時藥效最強，故確定乙醇提取物、粗多糖和精多糖的最佳給藥濃度分別是1.84、0.24、0.16 mg/mL。在采用MTT法明確了無梗五加果實3種提取物對人肝癌細胞SMMC-7721的抑制作用后，進一步采用PI染色法和FITC-AnnexinⅤ/PI雙染色法分別觀察無梗五加果實3種提取物對人肝癌細胞SMMC-7721細胞周期和細胞凋亡的影響。研究發(fā)現(xiàn)，各提取物均可顯著降低G0/G1和G2/M期細胞的百分率，顯著升高S期細胞百分率，誘導細胞的凋亡。

試驗中之所以對粗多糖和精多糖分別進行考察，是因為粗多糖與精多糖相比，主要區(qū)別是粗多糖含有一定量的蛋白質。分別考察粗多糖和精多糖抗腫瘤作用的目的，主要就是排除蛋白質的干擾，為后續(xù)實驗進一步篩選抗腫瘤有效部位及單體奠定基礎。

綜合分析以上試驗結果，可初步推測無梗五加果實3種提取物的抗腫瘤作用可能是通過抑制腫瘤細胞的增殖和誘導細胞凋亡而產(chǎn)生的。

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（收稿日期：2017-09-27 修回日期：2017-11-11）

（編輯：林 靜）