姜黃素對體內外骨肉瘤細胞增殖和侵襲的影響及其機制研究

顏泉

中圖分類號 R738.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）07-0918-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.07.13

摘 要 目的：研究姜黃素對骨肉瘤細胞增殖和侵襲的影響及其機制。方法：體外細胞試驗分為對照組（二甲基亞砜），姜黃素低、中、高濃度組（10、20、40 ?mol/L），姜黃素高濃度+內源性微小核糖核酸-21模擬物（agomiR-21）組和姜黃素高濃度+agomiR-21陰性對照（NC）組，分別采用CCK-8和Transwell小室法檢測各組人骨肉瘤細胞U-2OS和MG-63的增殖[光密度（OD值）]和侵襲能力（穿膜細胞數），分別采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應法和Western blot法檢測各組細胞中miR-21及其靶基因PDCD4蛋白的表達。體內實驗將MG-63細胞接種至小鼠體內，然后將小鼠分為空白對照組（生理鹽水）、姜黃素組（20 mg/kg）、姜黃素+agomiR-21 NC組（20 mg/kg姜黃素溶液+50 mg/kg agomiR-21 NC溶液）、姜黃素+agomiR-21組（20 mg/kg姜黃素溶液+50 mg/kg agomiR-21溶液），每組8只，分別于瘤內注射相應藥物，每天1次，連續給藥7 d。測量給藥后20 d內的腫瘤體積變化，檢測第20天瘤組織中miR-21和PDCD4蛋白的表達。結果：與對照組比較，姜黃素低、中、高濃度組U-2OS、MG-63細胞的OD值和穿膜細胞數均明顯減?。≒<0.05或P<0.01）；其中姜黃素中、高濃度組U-2OS、MG-63細胞中miR-21的表達明顯減弱（P<0.05或P<0.01），PDCD4蛋白表達明顯增強（P<0.01）。與姜黃素高濃度+agomiR-21 NC組比較，姜黃素高濃度+agomiR-21組U-2OS、MG-63細胞的OD值和穿膜細胞數均明顯增加（P<0.01）。與空白對照組比較，姜黃素組和姜黃素+agomiR-21 NC組小鼠給藥5 d后腫瘤體積明顯減?。≒<0.05或P<0.01）；瘤組織中miR-21表達明顯減弱（P<0.01），PDCD4蛋白表達明顯增強（P<0.01）。與姜黃素+agomiR-21 NC組比較，姜黃素+agomiR-21組小鼠給藥5 d后腫瘤體積明顯增加（P<0.05或P<0.01）；瘤組織中miR-21表達明顯增強（P<0.01），PDCD4蛋白表達明顯減弱（P<0.01）。結論：姜黃素可抑制人骨肉瘤細胞U-2OS、MG-63的增殖和侵襲，其機制可能與下調miR-21表達有關。

關鍵詞 姜黃素；微小核糖核酸-21；骨肉瘤細胞；增殖；侵襲；體內；體外

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of curcumin on proliferation and invasion of osteosarcoma cells and its mechanism. METHODS： In in vitro cell assay， osteosarcoma cells were divided into control group（dimethyl sulfoxide）， curcumin low-concentration， medium-concentration and high-concentration groups （10， 20， 40 ?mol/L） and curcumin high-concentration+endogenous miR-21 simulacrum （agomiR-21） group， curcumin high-concentration+agomiR-21 negative control （NC） group. The proliferation （OD value） and invasion ability （transmembrane cells number） of human osteosarcoma cells U-2OS and MG-63 were detected by CCK-8 and Transwell chamber method； the expression of miR-21 and its target gene PDCD4 protein were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blot assay. In in vivo cell assay， MG-63 cells were inoculated in mice， and the mice were divided into blank control group （normal saline）， curcumin group （20 mg/kg）， curcumin+agomiR-21 NC group （20 mg/kg curcumin solution+50 mg/kg agomiR-21 NC solution）， curcumin+agomiR-21 group （20 mg/kg curcumin solution+50 mg/kg agomiR-21 solution） with 8 mice in each group； they were given intratumoral injection of relevant medicine once a day， for consecutive 7 d. The volume changes of the tumor were measured within 20 d after medication， and the expression of miR-21 and PDCD4 protein in tumor tissue were detected on 20th day. RESULTS： Compared with control group， the OD value and transmembrane cells number of U-2OS and MG-63 cells were decreased significantly in curcumin low-concentration， medium-concentration and high-concentration groups （P<0.05 or P<0.01）；the expression of miR-21 was weakened significantly in curcumin medium-concentration and high-concentration groups of U-2OS and MG-63 cells （P<0.05 or P<0.01）， while the expression of PDCD4 protein was strengthened significantly （P<0.01）. Compared with curcumin high-concentration+agomiR-21 NC group， the OD value and transmembrane cells number of U-2OS and MG-63 cells were strengthened significantly in curcumin high-concentration+agomiR-21 group （P<0.01）. Compared with blank control group， the tumor volume of mice were decreased significantly in curcumin group and curcumin+agomiR-21 NC group （P<0.05 or P<0.01）. The expression of miR-21 was decreased significantly in tumor tissue （P<0.01）， while the protein expression of PDCD4 was strengthened significantly （P<0.01）. Compared with curcumin+agomiR-21 NC group， the tumor volume of mice were increased significantly in curcumin+agomiR-21 group （P<0.05 or P<0.01）. The expression of miR-21 in tumor tissue were strengthened significantly （P<0.01）， while the expression of PDCD4 protein were weakened significantly （P<0.01）. CONCLUSIONS： Curcumin can inhibit the proliferation and invasion of human osteosarcoma cells U-2OS and MG-63， the mechanism of which may be associated with down-regulating the expression of miR-21.

KEYWORDS Curcumin； miR-21； Osteosarcoma cell； Proliferation； Invasion； in vivo； in vitro

骨肉瘤（Osteosarcoma）是最常見的原發于骨組織的惡性腫瘤，其惡性程度高、易復發和轉移，預后較差。目前骨肉瘤的治療方法依然是以手術為主，化療、放射治療為輔，但手術后局部腫瘤復發、轉移和多重耐藥性等因素嚴重影響了術后預后。因此，深入研究骨肉瘤發生發展的分子機制，探索新的、有效的治療藥物及骨肉瘤生物治療新的分子靶點，對改善骨肉瘤治療現狀有重要意義。

姜黃素（Curcumin）是從姜科植物姜黃的根莖中提取得到的一種酚性色素，是姜黃的主要有效成份之一，具有多方面的藥理作用，如抗炎、抗氧化、降脂、抗病毒、清除自由基及抗腫瘤等，其作為一種具有良好開發前景的抗腫瘤藥已日益引起人們的重視，成為當今科研的熱點[1]。已有研究發現，姜黃素可通過多種通路抑制腫瘤細胞的增殖、改變細胞周期、誘導細胞凋亡[2-3]，但其具體作用機制仍不清楚。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類非編碼RNA，長度約為19～25 bp。miRNA參與調控個體發育和細胞凋亡、增殖及分化等生命活動，與機體多種疾病的發生發展密切相關，在人類腫瘤中存在表達異常，發揮了促癌基因或者抑癌基因的功能[4]。已有研究發現，miRNA-21（miR-21）在多種腫瘤中表達異常，其通過調控多個腫瘤相關基因，如人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（PTEN）、程序性細胞凋亡因子4（PDCD4）、自殺相關因子配體（FasL）、超氧化物歧化酶3（SOD3）、B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）等[5-8]，發揮重要的促癌作用。已有研究發現，miR-21在骨肉瘤中表達顯著升高，與骨肉瘤的發生發展密切相關[9]，有望成為骨肉瘤治療的重要靶點。基于此，筆者研究了姜黃素對人骨肉瘤細胞增殖和侵襲的影響，及其與miR-21的關系，為闡明姜黃素在骨肉瘤中的抗癌機制提供重要的試驗依據，進一步為骨肉瘤的抗癌治療提供新的靶標。

1 材料

1.1 儀器

H1MF型酶標儀（美國Bio-Tek公司）；Ⅸ80型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；7500型熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）儀（美國ABI公司）；ChemiDoc Touch型蛋白印跡檢測分析儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

姜黃素原料藥（批號：MFCD00008365，純度：94%）、二甲基亞砜（DMSO，批號：D2650，純度：99%）均購自美國Sigma公司；內源性miR-21模擬物（agomiR-21，批號：B06001，純度：99%）和agomiR-21陰性對照（agomiR-21 NC，批號：B04008，純度：99%）均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；DMEM細胞培養基、胎牛血清（美國Gibco公司）；CCK-8細胞增殖檢測試劑 （日本Dojindo公司）；Transwell小室（美國Millpore公司）；Trizol總RNA提取試劑（美國Invitrogen公司）；RIPA細胞裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；miRNA qRT-PCR檢測試劑盒（美國Gene Copoeia公司）；兔抗人PDCD4多克隆抗體（美國Abcam公司）；兔抗人β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體（美國CST公司）；辣根過氧化物（HRP）酶標記山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG，北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.3 細胞

人骨肉瘤細胞U-2OS和MG-63均購自中國科學院上海細胞庫，由瀘州市人民醫院骨科室保存。

1.4 動物

SPF級重癥聯合免疫缺陷（SCID）小鼠32只，♂，體質量18～22 g，6～8周齡，均購自瀘州醫學院實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK（川）2013-065。

2 方法

2.1 細胞培養與分組

U-2OS、MG-63細胞采用含10%胎牛血清、100 u/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基培養，置于5%CO2、37 ℃恒溫恒濕培養箱中培養，取對數生長期的細胞進行試驗。體外細胞試驗分為對照組（DMSO），姜黃素低、中、高濃度組（10、20、40 ?mol/L，即4、8、16 mg/L），姜黃素高濃度+agomiR-21 NC組和姜黃素高濃度+agomiR- 21組。

2.2 荷瘤小鼠模型建立與分組

將0.2 mL（約1×106個）MG-63細胞懸液皮下注射于SCID小鼠的左后肢，每天觀察小鼠皮下腫瘤生長情況并記錄。待小鼠皮下腫瘤結節體積約為100 mm3時，即表明骨肉瘤荷瘤小鼠模型建立成功。將32只造模成功的小鼠隨機分為空白對照組（生理鹽水）、姜黃素組（20 mg/kg）、姜黃素+agomiR-21 NC組（20 mg/kg姜黃素溶液+50 mg/kg agomiR-21 NC溶液）、姜黃素+agomiR-21組（20 mg/kg姜黃素溶液+50 mg/kg agomiR-21溶液），每組8只，分別于瘤內注射相應藥物，每天1次，連續給藥7 d。自第1次給藥開始記時，每5天測量腫瘤大小1次，共測量4次，于第20天結束測量。頸椎脫位法處死小鼠，切取腫瘤，測量，按公式計算腫瘤體積，腫瘤體積=（W2×L）×1/2，式中，W為腫瘤最寬部分長度，L為腫瘤最長部分長度。

2.3 CCK-8法檢測細胞增殖能力

2.3.1 姜黃素對人骨肉瘤細胞增殖的影響 取對數生長期的U-2OS、MG-63細胞，分別以1×104 個/孔接種于96孔板中，培養12 h后，按“2.1”項下對照組和姜黃素低、中、高濃度組加藥，每組3個復孔，作用12、24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h，使用酶標儀在450 nm波長處測定細胞的光密度（OD）值，OD值越大表示細胞增殖能力越強。

2.3.2 過表達miR-21對姜黃素抑制人骨肉瘤細胞增殖的影響 取對數生長期U-2OS、MG-63細胞，分別以1×104 個/孔接種于96孔板中，培養12 h后，按“2.1”項下對照組、姜黃素高濃度+agomiR-21 NC組、姜黃素高濃度+ agomiR-21組加藥，每組3個復孔，作用48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h，使用酶標儀在450 nm波長處測定細胞的OD值。

2.4 Transwell小室法檢測細胞侵襲能力

取U-2OS、MG-63細胞，按“2.1”項下分組加藥，作用24 h后，將各組細胞分別接種于底膜基質膠預鋪的24孔板Transwell小室中，上室接種無血清培養基配制的細胞懸液200 ?L（約1×105個/孔），下室加入含10% 胎牛血清的培養基，37 ℃培養箱中孵育48 h，取出小室用棉簽擦去上室內的基質膠和細胞，4%多聚甲醛固定10～30 min后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗細胞3次，再用0.1%結晶紫染色20 min，清水洗3次，于100倍顯微鏡下觀察細胞穿膜細胞數（呈紫紅色的細胞），隨機選取5個視野計數，取平均數，穿膜細胞數越多表示侵襲能力越強。

2.5 qRT-PCR法檢測細胞中miR-21表達

取“2.3.1”項下處理24 h的U-2OS、MG-63細胞和“2.2”項下各組小鼠瘤組織，依據Trizol說明書提取總RNA，按照miRNA qRT-PCR檢測試劑盒說明書操作，將所得RNA反轉錄成cDNA，采用qRT-PCR法檢測細胞中miR-21表達水平。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，miR-21上游引物序列為：5′ -TAGTTATCAGACTGATGTTGA-3′ ，下游引物序列為：5′ - ACAACATCAGTCTTGATAACTA-3′ ，擴增長度為108 bp；snRNA U6（miRNA檢測內參）上游引物序列為：5′ -CGCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′ ，下游引物序列為：5′ -TATGGAACGCTTCACGAATTTGC-3′ ，擴增長度為120 bp。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40循環。采用 2-ΔΔct相對定量法（目的基因ct值/內參基因ct值）對miR-21表達進行相對定量。

2.6 Western blot法檢測細胞中PDCD4蛋白表達

取“2.3.1”項下處理24 h的U-2OS、MG-63細胞和“2.2”項下各組小鼠瘤組織，經RIPA裂解液裂解，提取蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取等量蛋白經10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉入聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，分別經5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，置于一抗[兔抗人PDCD4、β-actin多克隆抗體（1 ∶ 1 000）]中4 ℃孵育過夜，然后置于二抗[HRP標記山羊抗小鼠IgG（1 ∶ 10 000）]中室溫孵育2 h，將化學發光底物滴加至PVDF膜上，收集熒光信號，分析目的蛋白PDCD4與內參蛋白β-actin的灰度值，以目的蛋白灰度值與內參蛋白灰度值的比值表示PDCD4蛋白表達水平。

2.7 統計學方法

采用SPSS 13.0 軟件進行統計分析。數據以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 姜黃素對人骨肉瘤細胞的增殖和侵襲的影響

與對照組比較，姜黃素低、中、高濃度組U-2OS、MG-63細胞作用24、48 h的OD值均顯著減?。≒<0.05或P<0.01），作用48 h的穿膜細胞數明顯減少（P<0.05或P<0.01）。表明姜黃素對U-2OS、MG-63細胞增殖和侵襲均有抑制作用。姜黃素對U-2OS、MG-63細胞增殖能力的影響結果見表1，侵襲能力的影響結果見表2。

3.2 過表達miR-21對姜黃素抑制人骨肉瘤細胞增殖和侵襲的影響

與對照組比較，姜黃素高濃度+agomiR-21 NC組U-2OS、MG-63細胞的OD值和穿膜細胞數明顯減小；與姜黃素高劑量+agomiR-21 NC組比較，姜黃素高劑量+ agomiR-21組U-2OS、MG-63細胞的OD值和穿膜細胞數明顯增加。表明人骨肉瘤細胞中加入姜黃素后，如果再加入agomiR-21使miR-21過表達會減弱姜黃素對人骨肉瘤細胞增殖和侵襲的抑制效果。過表達miR-21對姜黃素抑制U-2OS、MG-63細胞增殖和侵襲的影響見表3。

3.3 姜黃素對人骨肉瘤細胞中miR-21和PDCD4蛋白表達的影響

與對照組比較，姜黃素中、高濃度組U-2OS、MG-63細胞中miR-21表達明顯減弱（P<0.05或P<0.01），PDCD4蛋白表達明顯增強（P<0.01）。姜黃素對U-2OS、MG-63細胞中miR-21和PDCD4蛋白表達的影響結果見表4。

3.4 姜黃素對小鼠腫瘤生長的影響

與空白對照組比較，姜黃素組和姜黃素+agomiR-21 NC組小鼠給藥5 d后腫瘤體積明顯減?。≒<0.05或P<0.01）；與姜黃素+agomiR-21 NC組比較，姜黃素+agomiR-21組小鼠給藥5 d后腫瘤體積明顯增加（P<0.05或P<0.01）。說明姜黃素能抑制小鼠的腫瘤生長，但是如果過表達miR-21就會減弱姜黃素對小鼠腫瘤生長的抑制作用。各組小鼠腫瘤體積的測定結果見表5。

3.5 姜黃素對小鼠瘤組織中miR-21和PDCD4蛋白表達的影響

與空白對照組比較，姜黃素組和姜黃素+agomiR- 21 NC組小鼠瘤組織中miR-21表達明顯減弱（P<0.01），PDCD4蛋白表達明顯增強（P<0.01）；與姜黃素+agomiR-21 NC組比較，姜黃素+agomiR-21組小鼠瘤組織中miR-21表達明顯增強（P<0.01），PDCD4蛋白表達明顯減弱（P<0.01）。各組小鼠瘤組織中miR-21和PDCD4蛋白表達的測定結果見表6。

4 討論

骨肉瘤是最常見的惡性骨腫瘤，致死率及致殘率極高。骨肉瘤的治療包括手術治療和化療，目前用于骨肉瘤治療的化療藥物主要有阿霉素、順鉑、甲氨蝶呤、異環磷酰胺4類[10]，但目前用于化療的藥物對骨肉瘤細胞和人體正常細胞均有明顯的殺傷作用，不良反應較大，因此新的輔助化療藥物和化療策略的研究對骨肉瘤的治療意義重大。

姜黃素對多種腫瘤具有殺傷作用，如骨肉瘤、淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、腸癌、卵巢癌等[11]。由于姜黃素是從植物中提取的天然色素，對人體幾乎沒有副作用，因此可作為一種有潛力的高效低毒抗腫瘤藥物應用于臨床。但由于姜黃素難溶于水，致使其口服生物利用度低，體內半衰期很短，難以達到有效血藥濃度，限制了其應用。因此，提高姜黃素生物利用度，深入闡明其藥理機制意義重大。

miRNA主要通過識別靶標mRNA分子的3′ 端非翻譯區域（3′ -UTR）的特異性結合位點，通過與靶標mRNA分子完全互補配對或部分配對來抑制mRNA轉錄后的翻譯。已有研究證實，PDCD4是miR-21的直接靶基因，是miR-21在多種腫瘤中發揮促癌作用的重要通路之一[5-8]。本研究發現，姜黃素可以下調骨肉瘤細胞中miR-21的表達，從而減弱了miR-21對靶基因PDCD4的抑制作用，并抑制骨肉瘤細胞的增殖和侵襲，在骨肉瘤模型小鼠體內也發現姜黃素能通過下調miR-21而發揮抑制腫瘤生長的抗腫瘤作用。本研究結果從表觀遺傳學調控方面證實了姜黃素可通過下調促癌基因miR-21的表達，上調PDCD4蛋白表達發揮抗骨肉瘤作用，這為證明姜黃素在骨肉瘤中的抗癌機制提供了實驗依據。

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（收稿日期：2017-08-24 修回日期：2018-01-15）

（編輯：鄒麗娟）