HPLC法測定綠芫菁中斑蝥素的含量

王騰蛟 趙成堅 谷穎樂 徐永莉 李力

中圖分類號 R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）07-0930-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.07.16

摘 要 目的：建立綠芫菁中斑蝥素的含量測定方法，并將測定結(jié)果用于篩選提取斑蝥素來源藥材的依據(jù)。方法：以丙酮為溶劑，采用超聲提取法提取綠芫菁中斑蝥素；采用高效液相色譜法測定斑蝥素的含量；色譜柱為C18，流動相為甲醇-水（23 ∶ 77），檢測波長為230 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，進樣量為10 μL；檢測綠芫菁中斑蝥素的含量并與采用《中國藥典》方法（以氯仿為提取溶劑）測定含量的結(jié)果進行比較。結(jié)果：斑蝥素檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.2～1.0 mg/mL（r=0.998 8），平均方法回收率為101.1%（RSD為1.7%，n=6）；綠芫菁中斑蝥素的平均含量為0.932%（n=3），采用《中國藥典》方法測得的含量為0.793%（n=3），均高于《中國藥典》項下斑蝥素來源藥材中斑蝥素含量需大于0.35%的要求。結(jié)論：建立的綠芫菁中斑蝥素的含量測定方法準(zhǔn)確可靠；綠芫菁中斑蝥素的含量達(dá)到《中國藥典》的要求，可用作提取斑蝥素的來源藥材。

關(guān)鍵詞 綠芫菁；斑蝥素；高效液相色譜法；丙酮提取；含量測定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for content determination of cantharidin in Lytta caraganae， and to use the result as the extract screening evidence of L. caraganae source material. METHODS： Ultrasonic extraction method was used to extract cantharidin from L. caraganae using acetone as solvent. HPLC method was adopted to determine the content of cantharidin. The determination was performed on C18 column with mobile phase consisted of methanol-water （23 ∶ 77） at flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set 230 nm， the column temperature was set at 35 ℃， and sample size was 10 μL. The content of cantharidin in L. caraganae was determined and compared with the results of content determination by the method stated in Chinese Pharmacopeia （using chloroform as extraction solvent）. RESULTS： The liner range of cantharidin were 0.2-1.0 mg/mL （r=0.998 8） with average methodology recovery rates of 101.1% （RSD=1.7%， n=6）. The average content of cantharidin in L. caraganae was 0.932% （n=3）， while the content of cantharidin was 0.793% （n=3） determined by the method stated in Chinese Pharmacopeia. Both were higher than the requirement of Chinese Pharmacopeia that the content of cantharidin in scource material of cantharidin was higher than 0.35%. CONCLUSIONS： Established method is accurate and reliable for the content determination cantharidin in L. caraganae. The content of cantharidin is up to the standard of Chinese Pharmacopeia， and can be used as source material for exacting cantharidin.

KEYWORDS Lytta caraganae； Cantharidin；HPLC； Acetone extraction； Content determination

芫菁為鞘翅目（Coleoptera）芫菁科（Meloidae）昆蟲的通稱，是多食亞目的一個重要類群，又名斑蝥或地膽、葛上亭長。斑蝥入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其具有破血逐瘀、散結(jié)消癥、攻毒蝕瘡的功效[1]，用于治療癥瘕、經(jīng)閉、頑癬、瘰疬、贅疣、癰疽不潰、惡瘡死肌等癥。現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)將斑蝥中主要成分斑蝥素（Cantharidin，CTD，C10H12O4）用于治療神經(jīng)性皮炎、顏面神經(jīng)麻痹、斑禿、頑癬、過敏性鼻炎等癥[2]，該成分還主要具有抗腫瘤活性。2015年版《中國藥典》（一部）所載藥用斑蝥有2種，即南方大斑蝥（大斑芫菁，Mylabris phalerata Pallas）和黃黑小斑蝥（眼斑芫菁，Mylabris cichorii Linnaeus）[3]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，南方大斑蝥中斑蝥素含量一般為 1.0%～1.2%，黃黑小斑蝥中斑蝥素含量為1.0% 左右，但亦有達(dá)1.3%者。另一種含斑蝥素的芫菁科昆蟲貴州短翅豆芫菁中斑蝥素含量為2.7%[4-6]。《中國藥典》規(guī)定藥材中斑蝥素含量不得少于0.35%[3]。隨著對斑蝥素研究的不斷深入，其來源藥材大斑芫菁和眼斑芫菁的數(shù)量急劇下降，故開發(fā)新的含有斑蝥素的昆蟲資源已經(jīng)迫在眉睫。綠芫菁屬于鞘翅目芫菁科綠芫菁屬（Lytta），又名青娘子，主要分布于北京、浙江、河北等省市以及東北三省、內(nèi)蒙古和新疆等自治區(qū)。綠芫菁成蟲和幼蟲中均含有斑蝥素，且這種野生昆蟲數(shù)量巨大，并已經(jīng)實現(xiàn)人工飼養(yǎng)[7-8]。已有利用貴州短翅豆芫菁等提取斑蝥素并測定其含量的報道[5]，但目前尚未見對綠芫菁中斑蝥素含量進行研究的報道。因此，本研究采用高效液相色譜（HPLC）法測定綠芫菁中斑蝥素的含量，通過其含量的高低確定是否可將綠芫菁作為提取斑蝥素的來源藥材。

1 材料

1.1 儀器

2695 HPLC儀、2489紫外檢測器（美國Waters公司）；KQ-700DV臺式數(shù)控超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；XS205 DualRange分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；Himac CR22G高速冷凍離心機（日本日立公司）；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA公司）。

1.2 藥材與試劑

綠芫菁購自河北安國中藥材市場，由廣西藥用植物園主任技師謝保令鑒定為正品（2017年9月）；斑蝥素對照品（上海柏卡化學(xué)技術(shù)有限公司，cas號：56-25-7，批號：MUST17022706，純度：>98%）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取斑蝥素對照品100.00 mg，加入乙腈使其溶解，稀釋并定容至100 mL量瓶中，搖勻，制備成1 mg/mL的對照品貯備溶液，并儲存在冰箱中。使用時，用乙腈稀釋成所需質(zhì)量濃度的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

將綠芫菁成體進行前處理。60 ℃烘干，粉碎，過篩。稱取粉末約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中；加入丙酮超聲處理（功率：400 W，頻率：40 kHz）3次（每次100 mL、50 min），合并丙酮溶液，過濾，用少量丙酮淋洗沉淀[8]。將提取出的斑蝥素混合液進行純化，先經(jīng)過無水碳酸鈉柱除油，再經(jīng)過無水硫酸鈉柱除水，并用少量丙酮淋洗柱子。將過柱液在具塞錐形瓶中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)濃縮致干（轉(zhuǎn)速80 r/min、溫度55 ℃），殘渣加入2 mL乙腈，搖勻，并用0.45 μm的一次性針筒過濾器過濾后，濾液保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 綠芫菁中斑蝥素的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為安捷倫公司的C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相為甲醇-水（23 ∶ 77，V/V）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為230 nm；柱溫為35 ℃；進樣量為10 μL。取“2.2”項下溶液在220～400 nm 波長下掃描，紫外吸收光譜見圖1；取“2.1”“2.2”項下溶液進色譜儀分析，理論板數(shù)按斑蝥素峰計應(yīng)不低于3 000。色譜圖見圖2。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密制備0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL系列質(zhì)量濃度的斑蝥素對照品溶液，進樣分析。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y）、斑蝥素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得回歸方程為y=103.5x-7.9（r=0.998 8）。表明斑蝥素檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.2～1.0 mg/mL。

2.3.3 精密度試驗 精密吸取0.4 mg/mL斑蝥素對照品溶液，連續(xù)進樣5次，每次10 μL，測定峰面積并計算RSD。結(jié)果，峰面積的RSD為0.4%（n=5），表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 稱取同一批干燥綠芫菁粉末，共4份，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定并計算RSD。結(jié)果，峰面積的RSD為0.8%（n=4），表明本方法重復(fù)性好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12 h注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果，峰面積的RSD為1.6%（n=5），表明供試品溶液在放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 油脂及水的干擾試驗 取0.2 mg/mL斑蝥素對照品溶液，精密吸取2.0 mL，分別置于10個離心管中，編號為1～10，均加入10 μL無水丙酮。將前5個離心管中的混合液分別過無水碳酸鈉柱和無水硫酸鈉柱，后5個離心管不過柱。取各管液進樣測定，計算其中斑蝥素的含量。

結(jié)果，編號1～5各管樣品中斑蝥素的平均含量為204.248 μg/L（RSD=0.7%，n=5），測量值與真實值偏差為2%；編號6～10各管樣品中的斑蝥素平均含量為167.900 μg/L（RSD=3.0%，n=5），測量值與真實值偏差為16%，表明油脂及水對試驗結(jié)果的干擾較大。因此，去除油脂及水后能顯著提高試驗結(jié)果的準(zhǔn)確度。

2.3.7 準(zhǔn)確度試驗 分別精密稱定已知含量的綠芫菁粉末1.0 g，共6份，各加入相同量的綠芫菁對照品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率。結(jié)果，斑蝥素的平均回收率為101.1%（RSD=1.7%，n=6），詳見表1。

2.3.8 樣品含量測定 取樣品3份，按照“2.2”項下方法制備成供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件，每份供試品連續(xù)進樣3次，每次進樣10 μL，記錄峰面積，計算綠芫菁中斑蝥素含量。結(jié)果，3份樣品藥材中斑蝥素含量分別為0.927%、1.000%、0.869%，平均值為0.932%，即每100 g藥材中含斑蝥素0.932 g，遠(yuǎn)高于藥典中對斑蝥素來源藥材的斑蝥素的含量要求。

2.3.9 《中國藥典》含量測定方法結(jié)果 在《中國藥典》[3]中，供試品溶液制備時采用氯仿超聲提取法提取藥材中斑蝥素，按照此法提取并測定綠芫菁中斑蝥素含量。結(jié)果，3份樣品藥材中斑蝥素平均含量為0.793%。表明采用本文建立的提取方法，且以丙酮作為提取試劑，能更多地提取出綠芫菁中的斑蝥素，提取率更高。

3 討論

3.1 提取時間考察

本文的提取方法為超聲提取法，超聲波可致生物體系發(fā)生各種生物效應(yīng)，其中包括破壞細(xì)胞后分離出某些成分。理論上，超聲時間越長對藥材細(xì)胞破壞越有利[9]。為了確定本品提取時的最優(yōu)超聲時間，筆者測定了供試品在加入20 mL丙酮后經(jīng)不同時間超聲（30、40、50 min）后斑蝥素的含量，各試驗3次。結(jié)果表明，超聲30、40、50 min時的峰面積分別為97.605、131.810、140.206，以超聲50 min時的峰面積最大，即提取出的斑蝥素含量最高，故最終選擇超聲時間為50 min。

3.2 樣品處理中的脫油、脫水操作

筆者在預(yù)試驗中，取用綠芫菁、大斑芫菁、眼斑芫菁3種藥材，在未進行脫油脂及脫水的情況下，發(fā)現(xiàn)綠芫菁經(jīng)旋干濃縮后油脂殘留較多，多次檢測后的結(jié)果顯示，與大斑芫菁和眼斑芫菁的供試品溶液比較，綠芫菁供試品溶液中有效成分的出峰時間不太穩(wěn)定，峰面積相對較低。故筆者認(rèn)為與斑芫菁和眼斑芫菁比較，在綠芫菁藥材中油脂和水分較多，且對含量測定影響較大。為了確保試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，清除樣品自身所含有物質(zhì)對試驗結(jié)果的影響，提高斑蝥素提取率，故本次研究時設(shè)計了油脂及水的干擾試驗。將供試品溶液通過無水硫酸柱和無水碳酸柱的方式進行脫油、脫水，既保證了各峰間分離度良好，又確保了試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.3 樣品提取溶劑的選擇

在提取綠芫菁的斑蝥素時，本研究使用的提取溶劑為丙酮，與《中國藥典》相關(guān)操作中使用的氯仿[3]相比，以丙酮為提取溶劑的提取率更高且操作性更強，與已有試驗結(jié)果報道一致[10-12]。這可能是因為丙酮沸點為56 ℃，而氯仿沸點為61 ℃，溫度高時更易破壞有效成分，所以用丙酮提取時有效成分相對破壞量更少，提取量更高[13]。二者的對比試驗結(jié)果也表明，使用丙酮為提取試劑時，綠芫菁中斑蝥素提取率更高。

從本研究的結(jié)果可知，綠芫菁體內(nèi)斑蝥素的含量達(dá)到0.932%，符合《中國藥典》中規(guī)定的斑蝥素含量不低于0.35%的要求[3]，即筆者認(rèn)為可將綠芫菁作為提取斑蝥素的藥材來源。由于近年來對具有抗癌作用的斑蝥素需求量的不斷增大，導(dǎo)致大斑芫菁和眼斑芫菁數(shù)量急劇下降，而開發(fā)新的含有斑蝥素的昆蟲資源，可緩解大斑芫菁和眼斑芫菁野生資源減少的壓力，促進生態(tài)平衡，同時滿足日益增長的斑蝥素的市場需求。

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（收稿日期：2017-11-16 修回日期：2018-01-24）

（編輯：劉 萍）