蟬蛻蛋白的提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性研究

李濤 程雪嬌 胡美變 劉玉杰 吳純潔

中圖分類號 R283 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）07-0968-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.07.25

摘 要 目的：優(yōu)化蟬蛻蛋白的提取工藝，并考察其體外抗氧化活性，為蟬蛻蛋白的深入研究提供參考。方法：以蛋白提取量為響應值，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應面法對超聲波輔助提取蟬蛻蛋白的液料比、超聲時間、提取次數(shù)等條件進行優(yōu)化，并進行驗證試驗。以維生素C（VC）為陽性對照，以對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和2，2′ -連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）自由基的清除率為指標，評價蟬蛻蛋白的體外抗氧化活性。結(jié)果：蟬蛻蛋白的最佳提取條件為液料比28 ∶ 1（mL/g），超聲時間65 min，提取2次。驗證試驗中，蟬蛻蛋白的平均提取量為65.45 mg/g（RSD=1.68%，n=3），與預測值的相對誤差為5.48%。蟬蛻蛋白對ABTS和DPPH自由基均有一定的清除效果，當蟬蛻蛋白質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時對ABTS自由基的清除率即達97.0%，其作用與VC相當；蟬蛻蛋白對DPPH自由基的清除能力稍弱，半數(shù)清除濃度為0.96 mg/mL，其作用不及VC。結(jié)論：采用Box-Behnken響應面法優(yōu)化蟬蛻蛋白的提取條件準確、可靠；蟬蛻蛋白具有一定的體外抗氧化活性。

關(guān)鍵詞 蟬蛻蛋白；超聲波輔助提取；工藝優(yōu)化；Box-Behnken響應面法；體外抗氧化活性

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize extraction technology of protein from Cryptotympana pustulata and investigate its in vitro antioxidant activity， so as to provide reference for further research of protein from C. pustulata. METHODS： Using extraction amount of protein as response value， based on single factor test， Box-Behnken response surface methodology was used to optimize the ratio of liquid to material， ultraonic time and extraction times. Validation test was conducted. Using Vitamin C （VC） as positive control， in vitro antioxidant activity of protein from C. pustulata was evaluated by using scavenging rate of 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） and 2，2′ -azino-bis（3-ethyl benzothiazoline-6-sulfonic acid） （ABTS） free radical as index. RESULTS： The optimal extraction condition of protein from C. pustulata was as follows as the ratio of liquid to material 28 ∶ 1 （mL/g）， ultrasonic time of 65 min， extracting for twice. In validation test， average extraction amount of protein from C. pustulata was 65.45 mg/g（RSD=1.68%，n=3）， relative error of which to predicted value was 5.48%. The protein from C. pustulata showed strong scavenging effect on ABTS and DPPH free radicals. When the concentration of protein from C. slough was 0.2 mg/mL， and the scavenging rate of it to ABTS free radicals was 97%， the effect of which was similar to VC. The protein from C. pustulata showed weak scavenging ability to DPPH free radical， IC50 was 0.96 mg/mL， the effect of which was not as good as VC. CONCLUSIONS： The extraction technology of protein from C. pustulata optimized by Box-Behnken response surface methodology shows high accuracy and good reliability. The protein from C. pustulata shows certain antioxidant activity in vitro.

KEYWORDS Protein from Cryptotympana pustulata； Ultrasonic assisted extraction； Technology optimization； Box-Behnken response surface methodology； Antioxidant activity in vitro

蟬蛻為蟬科昆蟲黑蚱（Cryptotympana pustulata Fabricius）的若蟲羽化時脫落的皮殼，味甘，性寒，入肺、肝經(jīng)，具有疏散風熱、明目退翳、利咽、解痙等功效[1]。蟬蛻屬于臨床用量較大的動物藥之一，已有兩千多年的用藥歷史，其既可內(nèi)服也可外用。現(xiàn)代藥理研究表明，蟬蛻具有解熱、祛痰平喘、抗驚厥、興奮子宮平滑肌和改善血液流變學等藥理作用[2-4]，因其療效確切且安全性較高，在兒科、神經(jīng)科、五官科等均得到了廣泛的應用，主要用于治療小兒夜啼、小兒抽動癥、咳嗽、腎炎、產(chǎn)后急性尿潴留等疾病[5-6]。

動物藥的主要化學成分是蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸，近年來許多學者對多種動物藥的蛋白質(zhì)展開研究，發(fā)現(xiàn)動物藥的蛋白質(zhì)具有多種藥理作用，如抗氧化、抗凝血、抗腫瘤、降血糖和抗肝纖維化等[7-11]。目前，關(guān)于蟬蛻的現(xiàn)代研究甚少，關(guān)于其研究多集中于氨基酸與微量元素方面，尚未見蟬蛻蛋白質(zhì)（以下簡稱“蟬蛻蛋白”）提取條件優(yōu)化及抗氧化活性的相關(guān)報道。因此，筆者擬通過超聲波輔助提取蟬蛻蛋白，采用Box-Behnken響應面法優(yōu)化其提取工藝，并對最優(yōu)條件提取的蟬蛻蛋白進行體外抗氧化活性研究，為蟬蛻蛋白的深入研究提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；PHS-3C精密酸度計（上海雷磁儀器廠）；DB-206SC電熱鼓風恒溫干燥箱（成都天宇試驗設(shè)備有限責任公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

蟬蛻飲片購自成都岷江源藥業(yè)股份有限公司（批號：20160810，產(chǎn)地：四川），經(jīng)成都中醫(yī)藥大學盧先明教授鑒定為蟬科昆蟲黑蚱的若蟲羽化時脫落的皮殼；維生素C（VC，成都市科龍化工試劑廠，批號：2015121901，純度：>99.7%）；牛血清白蛋白（上海伯奧生物科技有限公司，批號：090165，純度：>99.0%）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，美國Sigma公司，批號：D9132，純度：>97%）；2，2′ -連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）（ABTS，上海美侖生物技術(shù)有限公司，批號：D1220A，純度：>99%）；甲醇、乙醇、石油醚（沸點：30～60 ℃）、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、過硫酸鉀等試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 蛋白含量的測定

以牛血清白蛋白為對照品，采用福林酚法[12]測定樣品中蛋白含量。堿性銅試液的制備：分別稱取碳酸鈉10 g、氫氧化鈉2 g和酒石酸鉀鈉0.25 g，溶于500 mL水中，作為A液；再稱取硫酸銅0.5 g，溶于100 mL水中，作為B液；將A液與B液按50 ∶ 1的體積比混勻，即得。

2.1.1 標準曲線的繪制 取牛血清白蛋白15.0 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加水定容至刻度，即得0.6 mg/mL的牛血清白蛋白對照品溶液。分別精密量取上述對照品溶液0、1、2、3、4、5 mL至5 mL的量瓶中，加水定容至刻度，即得不同質(zhì)量濃度（0.00、0.12、0.24、0.36、0.48、0.60 mg/mL）的對照品溶液。精密量取各質(zhì)量濃度的對照品溶液1.0 mL，分別置于具塞試管中，分別加入堿性銅試液5.0 mL，搖勻，室溫靜置10 min后，向各試管中加入福林酚試液（取2 mol/L 福林酚試劑1 mL，加水至2 mL）0.5 mL，立即混勻，室溫放置30 min，采用紫外-可見分光光度計于650 nm波長處測定吸光度。以牛血清白蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標（x，mg/mL）、吸光度為縱坐標（y）繪制標準曲線，得標準曲線方程為y=1.011 1x+0.061 9（r2=0.999 8），表明牛血清白蛋白檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.12～0.60 mg/mL。

2.1.2 樣品中蛋白含量的測定 取蟬蛻適量，置于40 ℃烘箱中烘干，粉碎過三號篩，室溫條件下按6 ∶ 1（V/m，mL/g）的液料比加入石油醚脫脂3次，每次1 h。脫脂后揮干石油醚，40 ℃干燥，即得蟬蛻脫脂粉末。精密稱取蟬蛻脫脂粉末2 g，置于錐形瓶中，按一定液料比加入75%乙醇，然后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH至10，超聲提取（超聲功率為200 W，頻率為40 kHz）一定的時間和次數(shù)，提取液濾過，濾液置于250 mL量瓶中，加水定容至刻度，按照“2.1.1”項下操作，測定樣品溶液的吸光度并計算蛋白含量。

2.1.3 精密度試驗 精密量取“2.1.1”項下質(zhì)量濃度為0.36 mg/mL的對照品溶液1.0 mL，按“2.1.1”項下方法測定其吸光度，并計算樣品中蛋白的含量，平行測定6次。結(jié)果，蛋白含量的RSD為1.87%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.4 重復性試驗 精密稱取蟬蛻脫脂粉末6份，每份2 g，根據(jù)得到的最優(yōu)工藝條件按“2.1.2”項下方法進行提取，按“2.1.1”項下方法測定其吸光度，并計算樣品中蛋白的含量。結(jié)果，樣品中蛋白含量的RSD為1.45%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 精密稱取蟬蛻脫脂粉末2 g，根據(jù)得到的最優(yōu)工藝條件按“2.1.2”項下方法進行操作，依法加入堿性銅和福林酚試液后搖勻，按“2.1.1”項下方法測定分別放置30、40、45、50、55、60 min時樣品的吸光度，并計算樣品中蛋白的含量。結(jié)果，樣品中蛋白含量的RSD為1.65%（n=6），表明該法在顯色后60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 準確度試驗 精密稱取6份已測定蛋白含量的蟬蛻脫脂粉末（含蛋白130.10 mg），加入等量的牛血清白蛋白，稀釋至適宜濃度，根據(jù)得到的最優(yōu)工藝條件按“2.1.1”項下方法操作并測定樣品的吸光度，并計算樣品中蛋白的含量。結(jié)果，蟬蛻蛋白的平均加樣回收率為99.4%，RSD為2.35%（n=6），表明該方法準確度較高。

2.2 單因素試驗優(yōu)化蟬蛻蛋白的提取工藝

蟬蛻蛋白的提取量受多種因素的影響，蛋白含有可解離的氨基和羧基，pH會影響解離基團的解離、改變蛋白所帶電荷，從而影響蛋白的溶解性[13]。查閱大量文獻發(fā)現(xiàn)，液料比、提取時間、提取次數(shù)是影響蛋白提取率的關(guān)鍵因素[14-17]。故本研究選樣品溶液pH、液料比、超聲時間、提取次數(shù)為因素，考察其對蟬蛻蛋白提取量的影響。

2.2.1 樣品溶液pH對蟬蛻蛋白提取量的影響 精密稱取蟬蛻脫脂粉末2 g，置于錐形瓶中，加入15倍量75%乙醇，用氫氧化鈉分別調(diào)樣品溶液pH至7、8、9、10、11，室溫超聲提取2次，每次60 min。提取液濾過，合并濾液，加水定容至250 mL，按照“2.1.1”項下操作，測定樣品吸光度并計算其中蛋白含量，結(jié)果見圖1A。

由圖1A可知，蟬蛻蛋白提取量隨樣品溶液pH的增大而增大，當樣品溶液pH小于10時，隨著溶液pH的增大蟬蛻蛋白提取量變化較快，當樣品溶液pH大于10時，變化趨于平緩，考慮到強堿可能會導致蟬蛻蛋白結(jié)構(gòu)破壞，從而引起蛋白變性失活，因此本研究將蟬蛻蛋白提取液的pH固定為10。

2.2.2 液料比對蟬蛻蛋白提取量的影響 精密稱取蟬蛻脫脂粉末2 g，置于錐形瓶中，分別按10 ∶ 1、15 ∶ 1、20 ∶ 1、25 ∶ 1、30 ∶ 1（V/m，mL/g）的液料比加入相應量的75%乙醇，用氫氧化鈉調(diào)溶液pH至10，室溫超聲提取60 min，提取2次，濾過，合并2次提取液；將提取液加水定容至250 mL，按照“2.1.1”項下操作測定樣品溶液吸光度并計算其中蛋白含量，結(jié)果見圖1B。

由圖1B可知，蟬蛻蛋白的提取量隨著液料比的增加而增大，當液料比達到25 ∶ 1時，提取量達到最大，此后繼續(xù)增加液料比，蛋白提取量變化比較緩慢。故選擇液料比25 ∶ 1作為響應面分析液料比因素的中心點。

2.2.3 超聲時間對蟬蛻蛋白提取量的影響 精密稱取蟬蛻脫脂粉末2 g，置于錐形瓶中，加入25倍量的75%乙醇，用氫氧化鈉調(diào)溶液pH至10，分別于室溫條件下超聲提取30、45、60、75、90 min，提取2次，濾過，合并濾液，加水定容至250 mL，按照“2.1.1”項下操作測定樣品溶液吸光度并計算其中蛋白含量，結(jié)果見圖1C。

由圖1C可知，超聲時間少于60 min時，蟬蛻蛋白提取量隨著超聲時間的延長而增加；超聲時間為60 min時，蛋白提取量最大，繼續(xù)延長超聲時間，蛋白提取量有降低的趨勢，這可能是由于超聲時間過長，蛋白發(fā)生降解造成的。故選擇超聲時間60 min作為響應面分析超聲時間因素的中心點。

2.2.4 提取次數(shù)對蟬蛻蛋白提取量的影響 精密稱取蟬蛻脫脂粉末2 g，置于錐形瓶中，加入25倍量75%乙醇，用氫氧化鈉調(diào)溶液pH至10，室溫超聲提取60 min，分別提取1、2、3、4、5次，提取液濾過，合并濾液，加水定容至250 mL。按照“2.1.1”項下操作測定樣品溶液吸光度并計算其中蛋白含量，結(jié)果見圖1D。

由圖1D可知，提取1次時蟬蛻蛋白不能被很好地提取出來，提取次數(shù)超過2次時，隨著提取次數(shù)的增加，蛋白提取量略有提高，但變化較緩慢。故選擇提取次數(shù)為2次作為響應面分析提取次數(shù)因素的中心點。

2.3 Box-Behnken響應面法優(yōu)化蟬蛻蛋白的提取工藝

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，最終選擇液料比（X1）、超聲時間（X2）、提取次數(shù)（X3）為因素，以蟬蛻蛋白提取量（Y）為響應值，進行3因素3水平的Box-Behnken試驗設(shè)計，以優(yōu)化蟬蛻蛋白的提取工藝，總共設(shè)計了17組試驗點，因素與水平見表1，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

采用Design-Expert 8.0.5軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行分析，得到超聲輔助提取蟬蛻蛋白的二次回歸方程為Y=64.90+5.00X1+6.38X2+9.23X3+1.26X1X2+3.26X1X3+1.04X2X3-5.92X12-10.46X22-14.74X32，方差分析結(jié)果見表3。

由表3可知，本研究所選模型的P<0.000 1，表明該模型具有顯著性；同時，失擬項的P=0.114 9>0.05，不具有顯著性，表明模型無誤，模型擬合度較好；R2=0.994 8，Radj2=0.972 3說明該模型可以解釋97.23%的數(shù)據(jù)。綜上所述，該模型具有較好的準確性和可靠性，可用于超聲輔助提取蟬蛻蛋白量的預測和分析。方差分析結(jié)果表明，液料比、超聲時間和提取次數(shù)對蟬蛻蛋白提取量均具有顯著影響，影響大小為提取次數(shù)>提取時間>液料比，且液料比、提取次數(shù)和液料比、超聲時間的交互作用及二次項對蟬蛻蛋白提取量均具有顯著影響。

2.4 響應面分析

將一個因素固定在零水平，通過對表2的數(shù)據(jù)進行響應曲面分析，考察另兩個交互因素對蟬蛻蛋白提取量的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，液料比和超聲時間對蟬蛻蛋白提取量有影響，固定液料比不變，隨著超聲時間的延長蟬蛻蛋白提取量先增加后降低；固定超聲時間不變，蟬蛻蛋白提取量隨液料比的增加而提高，且超聲時間對蟬蛻蛋白提取量的影響較大。液料比和提取次數(shù)交互作用的等高線圖較橢圓，表明其對蟬蛻蛋白提取量具顯著影響，曲線的左側(cè)較右側(cè)陡峭，表明提取次數(shù)影響較大。超聲時間與提取次數(shù)的交互作用等高線圖較圓，說明其影響不顯著。得到蟬蛻蛋白的最優(yōu)提取工藝為液料比27.84 ∶ 1（mL/g）、提取時間65.38 min、提取次數(shù)2.39次，此時蟬蛻蛋白提取量為69.25 mg/g。

2.5 驗證試驗

考慮到實際的可操作性，將上述得到的最優(yōu)工藝條件進行了修正，最終確定蟬蛻蛋白的提取條件為：取樣量2 g，液料比（28 ∶ 1，V/m，mL/g），超聲時間65 min，提取2次。以修正后的條件進行驗證試驗，平行3次，最終得到的蟬蛻蛋白提取量為65.45 mg/g（RSD=1.68%，n=3），與預測值（69.25 mg/g）的相對誤差為5.48%，表明該模型準確可靠[18-19]。

2.6 蟬蛻蛋白的體外抗氧化活性研究

將最優(yōu)條件下提取獲得的提取液用鹽酸調(diào)pH至蟬蛻蛋白的等電點（pH=5.8），然后以離心半徑為9.5 cm、5 000 r/min離心10 min，純凈水洗滌沉淀2次，合并洗液，調(diào)溶液pH至中性，置于透析袋中，4 ℃透析48 h，冷凍干燥，純凈水復溶至所需質(zhì)量濃度，對其進行體外抗氧化活性研究。

2.6.1 DPPH自由基清除能力測定 參照文獻[20]方法，分別取2 mL不同質(zhì)量濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的蟬蛻蛋白溶液和VC溶液于具塞刻度試管中，再分別加入2 mL DPPH溶液（用無水乙醇稀釋制備成0.2 mmol/L），混合均勻，避光條件下室溫反應30 min，于517 nm波長處測定溶液的吸光度，每個樣品重復試驗3次，取平均值，并計算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率=[1-（As-A0）/Ac]×100%，其中，As為樣品與DPPH混合液的吸光度，A0為樣品與無水乙醇混合液的吸光度，Ac為純凈水與DPPH混合液的吸光度，結(jié)果見表4。

由表4可知，蟬蛻蛋白對DPPH自由基具有一定的清除活性，但與活性較強的VC相比，其對DPPH自由基清除能力較弱。在質(zhì)量濃度為0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，蟬蛻蛋白對DPPH自由基清除率隨著蛋白濃度升高而增強，其半數(shù)清除濃度（IC50）為0.96 mg/mL。

2.6.2 ABTS自由基清除能力測定 參照文獻方法[21]，制備7 mmol/L的ABTS溶液和2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液，將兩溶液等體積混合，室溫、避光條件下反應過夜，作為母液。吸取1 mL的母液，用45 mL的甲醇稀釋至在734 nm波長處的吸光度為0.7±0.005，即為ABTS的工作液。分別取2 mL的蟬蛻蛋白溶液和VC溶液（質(zhì)量濃度均分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）于具塞刻度試管中，再加入4 mL的ABTS工作液，避光反應6 min，734 nm波長處測吸光度，每個樣品重復試驗3次，取平均值，并計算其對ABTS自由基的清除率：ABTS自由基清除率（%）=[1-（As-A0）/Ac]×100%，其中，As為樣品與ABTS混合液的吸光度，A0為樣品與甲醇混合液的吸光度，Ac為純凈水與ABTS混合液的吸光度，結(jié)果見表4。

由表4可知，蟬蛻蛋白與VC對ABTS自由基均具有較強的清除活性。在質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時，蟬蛻蛋白對ABTS+自由基清除率即達97.0%，其作用與VC相當。

3 討論

筆者在前期試驗中考察了提取溶劑和提取方法對蟬蛻蛋白提取量的影響，分別以水和不同濃度的乙醇作為提取溶劑，結(jié)果以75%乙醇作為提取溶劑時蛋白提取量較高，且超聲輔助提取較浸提法提取得率高、提取時間短，故本研究以75%乙醇作為提取溶劑，采用超聲輔助提取法提取蟬蛻蛋白。在超聲提取過程中，隨著超聲時間的延長，超聲溫度會逐漸升高，易使蛋白受熱變性[22]，為控制超聲溫度，筆者每隔15 min更換1次超聲提取器里的水以使其保持常溫，從而減少對提取蛋白的破壞。試驗過程中，用鹽酸調(diào)節(jié)蟬蛻蛋白提取液的pH值使蛋白沉淀，通過稱量沉淀物的質(zhì)量確定蟬蛻蛋白的等電點（質(zhì)量最大時對應的pH值）為5.8。通過研究福林酚法、考馬斯亮藍法和二哇啉甲酸法測定蟬蛻蛋白含量的差異，發(fā)現(xiàn)福林酚法測定結(jié)果準確，且有文獻報道對于多肽含量較高的蛋白質(zhì)含量的測定，選擇福林酚法測定較準確[23]，故本研究選擇福林酚法測定蟬蛻蛋白的含量。

本研究選擇液料比、超聲時間、提取次數(shù)為考察因素，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行Box-Behnken響應面試驗設(shè)計，優(yōu)選出蟬蛻蛋白的提取工藝，通過方差分析和驗證試驗表明，此模型準確可靠。液料比、超聲時間和提取次數(shù)對蟬蛻蛋白提取量有顯著性影響，且影響大小為提取次數(shù)>超聲時間>液料比。通過響應面法優(yōu)選，結(jié)合實際情況確定了最優(yōu)提取條件：液料比為28 ∶ 1，超聲時間65 min，提取2次，此條件下進行3次驗證試驗，結(jié)果蟬蛻蛋白提取量為65.45 mg/g，與二次方程預測值接近。

動物藥為“血肉有情之品”，其因療效顯著、安全性高獲得廣大學者的關(guān)注，本結(jié)果表明，最優(yōu)條件下提取的蟬蛻蛋白具有較好的抗氧化活性，這可為天然抗氧化劑的開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。然而，本研究僅進行了體外抗氧化活性研究，故將在后續(xù)研究中需對其進行體內(nèi)抗氧化活性研究。

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（收稿日期：2017-10-24 修回日期：2018-01-17）

（編輯：林 靜）