新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物對結腸癌模型小鼠免疫功能的影響

李露 李偉 劉柏里 張海英 聶繼紅

摘 要 目的：研究新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物對結腸癌模型小鼠免疫功能的影響，為新疆阿魏屬植物的進一步開發利用提供參考。方法：體外接種小鼠結腸癌CT-26.WT細胞復制小鼠結腸癌模型。將造模的50只小鼠隨機分為模型組（生理鹽水，灌胃）、順鉑組（5 mg/kg，腹腔注射）和新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物低、中、高劑量組（按生藥量計分別為1.0、2.0、3.0 g/kg，灌胃），每組10只；另選10只正常小鼠作為空白組（生理鹽水，灌胃）。順鉑組小鼠隔天給藥1次，其余各組小鼠均每天給藥1次，連續給藥10 d。給藥結束后，測定各組小鼠抑瘤率和脾指數；采用流式細胞術測定各組小鼠血液中T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+以及B淋巴細胞CD19+的數量，并計算CD4+/CD8+值；酶聯免疫吸附法測定小鼠血清中免疫球蛋白M（IgM）、IgG的含量。結果：與空白組比較，模型組小鼠脾指數顯著升高（P<0.01），但血液中CD3+、CD4+、CD8+、CD19+細胞的數量以及血清中IgM、IgG含量差異無統計學意義（P>0.05）。與模型組比較，新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物各劑量組小鼠的瘤質量均顯著降低（P<0.01），抑瘤率均在40%以上；新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物中、高劑量組小鼠脾指數以及血液中CD3+細胞數量、CD4+細胞數量、CD4+/CD8+值和血清中IgM、IgG含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）；新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物各劑量組小鼠血液中CD19+細胞數量顯著減少（P<0.05或P<0.01），但血液中CD8+細胞數量差異均無統計學意義（P>0.05）。結論：新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物對結腸癌模型小鼠具有一定的改善作用，并可顯著提高小鼠自身的細胞免疫能力和體液免疫能力。

關鍵詞 新疆阿魏；乙酸乙酯部位；結腸癌模型；小鼠；免疫功能

中圖分類號 R284 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）21-2939-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.21.14

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of the extract from ethyl acetate part of Ferula sinkiangensis on immune function of colon cancer model mice， and to provide reference for further development and utilization of plants of the genus Ferula. METHODS： Colon cancer model mice were induced by incubated with colon cancer CT-26.WT cell. 50 model mice were randomly divided into model group （normal saline， i.g.）， cisplatin group （5 mg/kg， i.p.） and ethyl acetate part of F. sinkiangensis low-dose， medium-dose and high-dose groups （1.0， 2.0， 3.0 g/kg， calculated by crude drug， i.g.）， with 10 mice in each group. Other 10 normal mice were included in blank group （normal saline， i.g.）. Cisplatin group was given medicine every other day， and other groups were given medicine once a day， for consecutive 10 d. After medication， the inhibition rate of tumor and spleen index were determined. Flow cytometry was adopted to detect the number of blood T lymphocyte subsets CD3+， CD4+， CD8+ and B lymphocytes CD19+； CD4+/CD8+ value was calculated. ELISA method was adopted to detect the content of immune protein IgM and IgG in serum of mice. RESULTS： Compared with blank group， spleen index of mice was increased significantly in model group （P<0.01）. There was no statistical significance in the number of CD3+， CD4+， CD8+ and CD19+ cells in the blood， as well as the contents of lgM and lgG in the serum （P>0.05）. Compared with model group， the tumor mass of mice in ethyl acetate part of F. sinkiangensis groups were significantly reduced （P<0.01）， inhibitory rate of tumor was more than 40%. The spleen index， the number of CD3+ and CD4+， CD4+/CD8+ value， the contents of IgM and IgG in serum were increased significantly in ethyl acetate part of F. sinkiangensis medium-dose and high-dose groups （P<0.05 or P<0.01）. The number of CD19+ cells in blood was decreased significantly in ethyl acetate part of F. sinkiangensis groups（P<0.05 or P<0.01）. There was no statistical significance in the number of CD8+ cells in blood （P>0.05）. CONCLUSIONS： The extract from ethyl acetate part of F. sinkiangensis shows inhibitory effect on colon cancer model mice， and can significantly improve cellular immunity function and humoral immunity function.

KEYWORDS Ferula sinkiangensis； Ethyl acetate part； Colon cancer model； Mice； Immune function

阿魏為傘形科植物新疆阿魏（Ferula sinkiangensis K.M.Shen）或阜康阿魏（Ferula fukanensis K.M.Shen）的樹脂[1]，為新疆特色珍貴藥材，在治療腫瘤、風濕性關節炎、胃痛等方面有獨特的優勢[2-3]。本課題組前期研究已證實，新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物能夠有效抑制結腸癌腫瘤的生長[4]。隨著對免疫系統與腫瘤作用關系的不斷研究，發現腫瘤在發生發展過程中與機體的免疫功能異常有著非常密切的聯系，機體免疫功能下降，可導致腫瘤轉移、復發和預后效果差[5]。機體對腫瘤的免疫方式主要有細胞免疫、體液免疫和分泌細胞因子三種。在細胞免疫中，T淋巴細胞是最為重要的效應細胞，被認為是機體免疫系統對腫瘤的直接而又特異的識別者[6-7]，而T淋巴細胞又由多個不同的亞群（如CD3+、CD4+、CD8+等）組成，CD19+則用作標記B淋巴細胞[8]；體液免疫指標的變化也與腫瘤的發生發展有著密切的聯系，當腫瘤發生時，機體處于免疫抑制狀態，可能表現為體液免疫亢進，此時可以合成和分泌免疫球蛋白（如IgG、IgM等），執行機體的體液免疫[9-10]。在本研究中，筆者擬建立BALB/c小鼠結腸癌模型，從免疫角度出發，探討新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物治療小鼠結腸癌的作用機制，為新疆阿魏屬植物的進一步開發利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

IX71-12FL/PH倒置熒光顯微鏡（上海賴氏電子科技有限公司）；TGL-16B離心機（上海安亭科學儀器廠生產）；GUAVAEASYCYTE 8HT流式細胞儀（美國Millpore公司）；xMarkTM酶標儀（美國Thermo公司）。

1.2 藥品與試劑

新疆阿魏藥材（批號：20161012）由新疆省伊犁州食品藥品檢驗所提供；紅細胞裂解液Lysing Buffer 10X Concentrate和CD3-別藻藍蛋白（APC）、CD4-異硫氰酸熒光素（FITC）、CD8-多甲藻黃素-花青素5.5（Per-cy5.5）、CD19-藻紅蛋白（PE）兔抗鼠、CD19單克隆抗體（武漢博士德生物制劑有限公司）；青-鏈霉素混合液（美國Hyclone公司，批號：F170221）；順鉑注射液（江蘇豪森藥業集團有限公司，批號：170402，規格：6 mL ∶ 30 mg）；IgM、IgG酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（美國Gibco公司，批號：均為466659）。

1.3 動物與細胞

健康BALB/c小鼠60只，♀♂對半，體質量18～24 g，4～6周齡，購自新疆醫科大學動物中心，實驗動物生產合格證號：SYXK（新）2011-0001；小鼠結腸癌CT-26.WT細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

2 方法

2.1 新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物的制備

取100 g新疆阿魏，在研缽中研碎成細顆粒狀，過一號篩，以沸程為30～60 ℃的石油醚500 mL超聲（頻率53 Hz）提取40 min，以相同的方法將剩余殘渣連續提取2次脫脂后，過濾得濾渣約90 g。取提取殘渣，用95%乙醇回流提取3次，每次450 mL、提取1 h，合并3次濾液，減壓濃縮后硅藻土拌樣，用5倍量的乙酸乙酯超聲（頻率53 Hz）萃取5 min，靜置后以抽濾瓶濾過，將濾液濃縮干燥，即得阿魏乙酸乙酯部位浸膏（得率為16.3%），并測得其中阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C的含量分別為33.4、76.5、72.3 mg/g[11]。

2.2 造模、分組與給藥

將小鼠結腸癌CT-26.WT細胞復蘇，調整細胞密度為2×107個/mL，按0.1 mL/只分別接種于50只（♀♂對半）BABL/c小鼠左前肢腋窩下，復制結腸癌小鼠模型[12]。將造模的50只小鼠隨機分為模型組、順鉑組和新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物低、中、高劑量組，每組10只（♀♂對半）；另取10只（♀♂對半）正常小鼠作為空白組。從造模第2天開始給藥，給藥前24 h禁食不禁水。新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物低、中、高劑量組小鼠每天灌胃1次相應藥液1.0、2.0、3.0 g/kg（按生藥量計，給藥劑量根據本課題組前期研究[4]及預實驗結果調整后設置），順鉑組小鼠隔天腹腔注射1次5 mg/kg順鉑無菌生理鹽水溶液[4]，空白組和模型組小鼠每天灌胃1次生理鹽水，連續給藥10 d。在給藥期間，因順鉑組3只小鼠死亡、阿魏乙酸乙酯部位提取物高劑量組2只小鼠死亡，為了保證結果的均一穩定性，調整每組小鼠為7只。

2.3 抑瘤率和脾指數的測定

末次給藥1 h后，稱小鼠體質量，摘眼球取血，然后將小鼠處死，剝取左前肢皮下的瘤塊并稱質量（g），計算各組小鼠的抑瘤率[抑瘤率（%）=（模型組平均瘤質量-給藥組平均瘤質量）/模型組平均瘤質量×100%]。解剖小鼠，取脾組織，用吸水紙吸干水分，稱質量并計算各組小鼠的脾指數[脾指數=脾質量（mg）/體質量（g）]。然后將各組織置于-80 ℃冰箱中保存，備用。

2.4 血液中CD3+、CD4+、CD8+、CD19+細胞數量的檢測

采用流式細胞術進行檢測。吸取小鼠血樣100 ?L，置于2 mL不含肝素的EP管中，做好標記，分別加入2 ?L的CD4-FITC抗體和5 ?L的CD3-APC、CD8-Per- cy5.5、CD19-PE兔抗鼠抗體，振蕩混勻，室溫下避光反應15 min。然后在每個樣品中加入1.5 mL的紅細胞裂解液Lysing Buffer 10X Concentrate，染色，振蕩混勻，4 ℃下避光靜置15 min，再以1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀加入1 mL的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次，然后加入0.5 mL的PBS稀釋，混勻，上機檢測血液中CD3+、CD4+、CD8+、CD19+細胞的數量，并計算CD4+/CD8+值。

2.5 血清中IgM、IgG含量的測定

采用ELISA法進行檢測。將血液在室溫下靜置1 h左右，然后在4 ℃下以1 000 r/min離心10 min，收集血清。按照相應試劑盒說明書操作，檢測各組小鼠血清中IgM、IgG含量。操作結束后，在酶標儀上測量450 nm波長下各孔的光密度（OD）值，進行定量分析。

2.6 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行統計分析。實驗數據用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析和Scheffe檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組小鼠瘤質量和抑瘤率的測定結果

與空白組比較，模型組小鼠瘤質量顯著增加（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組小鼠瘤質量均顯著降低（P<0.01）。新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物各劑量組小鼠的抑瘤率均達到40%以上，且抑瘤效果具有一定的量效關系，高劑量新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物的抑瘤效果與陽性藥物順鉑相當。各組小鼠瘤質量和抑瘤率測定結果見表1。

3.2 各組小鼠脾指數的測定結果

與空白組比較，模型組小鼠體質量差異無統計學意義（P>0.05），但脾質量和脾指數均顯著增加（P<0.01）。與模型組比較，新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物各劑量組小鼠體質量差異均無統計學意義（P>0.05），而順鉑因具有一定的化學毒性，順鉑組小鼠的體質量顯著減輕（P<0.01）；新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物中、高劑量組小鼠的脾指數均顯著升高（P<0.01）。各組小鼠脾指數測定結果見表2。

3.3 各組小鼠血液中CD3+、CD4+、CD8+、CD19+細胞數量的測定結果

與空白組比較，模型組小鼠血液中CD3+、CD4+、CD8+、CD19+細胞數量差異均無統計學意義（P>0.05）。與模型組比較，順鉑組和新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物中、高劑量組小鼠血液中CD3+、CD4+細胞數量均顯著增加（P<0.05或P<0.01），新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物各劑量組小鼠血液中CD19+細胞數量顯著減少（P<0.05或P<0.01），并且新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物中、高劑量組小鼠血液中CD4+/CD8+值顯著升高（P<0.05或P<0.01），各給藥組小鼠血液中CD8+細胞數量差異均無統計學意義（P>0.05）。小鼠血液中CD3+細胞檢測的流式直方圖見圖1和CD4+、CD8+、CD19+細胞檢測的流式散點圖見圖2，測定結果見表3。

3.4 各組小鼠血清中IgM、IgG含量的測定結果

與空白組比較，模型組小鼠血清中IgM、IgG含量差異均無統計學意義（P>0.05）。與模型組比較，順鉑組和新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物低劑量組小鼠血清中IgM、IgG含量差異均無統計學意義（P>0.05），但新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物中、高劑量組小鼠血清中IgM、IgG含量均顯著增加（P<0.05或P<0.01），這提示新疆阿魏乙酸乙酯部位能夠提高結腸癌模型小鼠機體的體液免疫功能，且具有明顯的劑量依賴性。各組小鼠血清中IgM、IgG含量測定結果見表4。

4 討論

《抗腫瘤藥物藥效學指導原則》[13]規定，當天然藥物對腫瘤的抑制率大于40%時，就可判定其有一定的抗腫瘤作用。本研究結果顯示，新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物對結腸癌模型小鼠的抑瘤率分別為45.35%、80.59%、93.61%，均高于40%，提示該部位對結腸癌具有抑制作用。脾是重要的免疫器官，常被用來評估機體的免疫功能，脾指數也被當作參考判斷實驗藥物是否對機體的免疫功能有所提高的一項指標[14]。在本研究中，中、高劑量新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物可顯著提高結腸癌模型小鼠的脾指數，由此推測造模中小鼠接種腫瘤后，小鼠對腫瘤的排斥所產生的免疫功能增強，所以使得脾指數有所增加，新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物抑制結腸癌異位瘤與提高小鼠自身免疫應答有一定的關系。

細胞免疫在機體免疫對抗腫瘤中扮演著主要的角色[15]，而作為細胞免疫最重要的T淋巴細胞，則通過功能各異的T淋巴細胞亞群來發揮免疫調節作用。 其中，CD3+細胞分布在每個T淋巴細胞中，代表T淋巴細胞的總數，還可以作為鑒別T淋巴細胞的指標[16]。CD4+細胞主要是輔助體液免疫和細胞免疫，如果CD4+細胞的表達水平降低，那么免疫反應的誘導作用也會隨之降低，隨之機體的抗腫瘤能力也會降低[17]。CD8+細胞在免疫過程中起負調節作用，可抑制機體自身抗體的生成，是一種抑制性T淋巴細胞[18]。CD4+/CD8+值越低，越容易導致機體的免疫功能受損，識別和殺傷突變細胞的能力將下降，繼而為腫瘤迅速生長、轉移、繼發感染創造條件[19]。本研究流式細胞術檢測結果顯示，中、高劑量新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物和順鉑均顯著增加了小鼠血液中CD3+、CD4+細胞的數量，表明用藥后結腸癌模型小鼠存在免疫功能提高的現象；且中、高劑量新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物能升高模型小鼠血液中CD4+/CD8+的值，說明用藥后結腸癌模型小鼠的細胞免疫功能處于免疫亢進狀態，機體識別殺傷突變細胞的能力有所上升。CD19+細胞是由B淋巴細胞分泌的，具有兩個功能：一是能夠抑制反應性T淋巴細胞的活性；二是能夠抑制效應T淋巴細胞的增殖以及免疫球蛋白的產生，從而參與細胞免疫的過程[20]。CD19+細胞數量越多，機體效應T淋巴細胞活性就越低。本研究結果顯示，新疆阿魏乙酸乙酯部位各劑量組小鼠血液中CD19+細胞數量較模型組均顯著減少，表明新疆阿魏乙酸乙酯部位可能是通過降低小鼠體內CD19+細胞數量，來增加小鼠體內效應T淋巴細胞活性及免疫球蛋白的數量，從而參與機體的細胞免疫調節。

免疫球蛋白同T淋巴細胞亞群一樣，屬于機體免疫防御機制的重要組成部分。當B淋巴細胞受到抗原刺激時就會分泌免疫球蛋白（如IgA、IgM、IgG），這些抗體對B淋巴細胞的相關抗原進行識別，促進細胞與病原體的結合，進行體液免疫[21]。血清中免疫球蛋白的主要組成是IgG，其可激活補體以及調理吞噬功能，在機體二次免疫應答中扮演主要角色。本研究結果顯示，中、高劑量新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物均顯著提高了模型小鼠血清中IgM、IgG的含量，表明其提高了小鼠自身的體液免疫能力。

筆者選用抗腫瘤研究中最常用的順鉑為陽性對照，雖然順鉑抗腫瘤作用強，但是其是一種細胞非特異性藥物，是通過破壞細胞DNA 的功能而發揮作用的，所以其對機體免疫作用可能影響不大。在腫瘤形成過程中，惡變細胞在某些情況下能通過多種機制逃避機體的免疫監視，在體內迅速增殖，形成腫瘤[22]，這也可能是本研究中模型組小鼠各免疫指標與空白組比較沒有顯著差異的主要原因。但是用藥后反而可能刺激機體免疫的產生，這與本研究給藥后小鼠免疫水平升高的結果相吻合。另外，本研究結果顯示，新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物給藥后小鼠血液中CD8+細胞數量略有下降，而CD8+細胞數量越低表示免疫抑制越強，即小鼠的抵抗力就越強，這說明了小鼠機體內還處于自身免疫抗腫瘤狀態。

綜上所述，新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物對結腸癌模型小鼠具有較好的抑瘤作用，這可能與提高小鼠自身的細胞免疫和體液免疫能力有關。

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（收稿日期：2018-05-23 修回日期：2018-08-24）

（編輯：林 靜）