針刺對腦出血急性期血腫周圍腦組織中凋亡細胞及其百分率影響的時效關系

鄭笑男 張鐸 李平

摘要 目的：通過觀察針刺對腦出血模型大鼠血腫形成后不同時間的血腫周圍腦組織凋亡細胞及其百分率影響，研究針刺作用及其時效性的相關保護機制。方法：采用Wistar大鼠尾狀核自體血緩慢注入法制作腦出血模型。腦組織細胞凋亡率測定分別應用TUNEL法及流式細胞術。結果：腦出血急性期TUNEL陽性細胞率顯著升高，針刺各組均偏低，但高于假手術組，且針刺干預越早該比率越低；流式細胞檢測結果基本與其一致。結論：針刺治療能夠改善腦出血急性期所造成的血腫周圍腦組織相關的凋亡情況，從而在腦出血急性期起到保護腦組織的作用，且腦出血發生后針刺干預越早療效越好。

關鍵詞 針刺；腦出血急性期；實驗性腦血腫；細胞凋亡；TUNEL法；流式細胞術；腦保護機制；時效關系

Abstract Objective：To study the protection mechanisms of function and time-effect relationship of acupuncture method by observing apoptotic cell in cerebral hemorrhage model rats′ brain tissue around hematomas and its percentage effects at different times in acute cerebral hemorrhage.Methods：The Wistar rats model of ICH were established by infusing autologous blood into caudate nucleus through stereotaxis technique.Apoptosis rate of brain tissue was analyzed by Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling （TUNEL） and flow cytometry （FCM） methods.Results：TUNEL positive cell percentage had a significant rise at acute stage of ICH，yet the rates tended to reduce in all the groups，which was higher than that in sham-operated group，and higher acupuncture intervention with lower percentage.The result of FCM was basically consistent with it.Conclusion：Acupuncture treatment is able to ameliorate the apoptosis of brain perihematoma tissues of rats with ICH so as to protect the brain tissue from acute stage of ICH.And the earlier acupuncture intervention，the better curative effect will achieve.

Key Words Acupuncture； Acute stage of cerebral hemorrhage； Experimental cerebral hemorrhage； Apoptosis cells； TUNEL； FCM； Cerebral protection mechanisms； Time-effect relationship

中圖分類號：R245文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.044

腦出血，是指原發性非外傷性腦實質內出血，是急性腦血管疾病中的危重類型，也是嚴重危害人類健康的4大疾病之一，并有較高的發病率、死亡率、致殘率與較多的并發癥，且很多研究已經證實：它和高血壓病、高脂血癥、代謝綜合征等疾病有著密不可分的關聯。關于腦出血的病理生理機制較為復雜，尚未徹底闡明。目前比較公認的幾個重要病理環節例如血腫周圍腦組織內Ca+超載、興奮性氨基酸與抑制性氨基酸失穩態以及神經興奮性毒性作用的發生等。有研究已表明，凋亡機制參與了腦出血后繼發性神經元損傷的過程，且于凋亡機制中，以上提到的相關關鍵病理環節發揮了主導性的作用。

細胞凋亡，自從1972年被發現[1]以來，一直是細胞死亡研究領域的焦點話題。它是指為維持內環境穩定，由基因調控的細胞自殺過程。傳統意義上，細胞死亡包括細胞壞死與細胞凋亡，而二者大不相同，前者是無序變化的被動過程，且壞死細胞會發出危險信號，并引發炎性反應，對鄰近組織造成嚴重損害[2]；后者是有序變化的主動過程，涉及一系列基因的活化、表達及調控等的作用，但凋亡本身不屬于病理狀態下的自體損傷，而是為能更好地適應生存環境而主動爭取的一種死亡過程[3]，其生理影響及臨床意義具有重要的研究價值[4]。凋亡細胞有其獨特形態和生化特征：細胞核染色質固縮，DNA廣泛降解斷裂；細胞全面皺縮，細胞膜皺縮外突、包裹線粒體等細胞器、核片段形成凋亡小體[5]。細胞凋亡過程的詳細機制尚不完全明了，但總體上可以分為起始和效應2個階段。細胞凋亡的起始階段是細胞在感受到相應的信號刺激后胞內一系列開關的開啟或關閉；而凋亡一旦進入效應階段則不可逆轉，最終導致細胞死亡。細胞凋亡與許多學科都有著密切的聯系，包括發育生物學、免疫學與臨床醫學等。從臨床醫學角度而言，許多疑難病癥[6-14]的發病機制如血液病、艾滋病、腫瘤、自身免疫性疾病、膠原病、腦血管障礙、心血管疾病、肝臟疾病、皮膚病等均可通過細胞凋亡機制被揭示[15]。

近些年來，中醫治療比如針灸療法在腦出血治療的應用已是非常廣泛，且已取得了相當不錯的效果，因而它已成為整個腦出血治療體系中尤其是康復過程中不可或缺的一部分內容。如醒腦開竅針刺法或石氏中風單元療法的應用。有關腦出血分期的界定，一般劃分為4個階段：超急性期（發病后24 h之內）、急性期（發病后48 h至7 d）、亞急性期（發病后8 d至4周）、慢性期（發病后>4周）。許多患者從腦出血發病之刻起到開始接受臨床診治之時已經過了超急性期，所以急性期的診治顯得格外重要。本實驗選擇較權威的醒腦開竅針刺法中的2個主穴：雙側內關穴、人中穴，共同發揮醒腦開竅，疏通經絡的功效，以期為進一步提高腦出血療效和腦出血患者的生命質量，減輕患者家庭與社會的負擔做出貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用健康成年雄性Wistar大鼠135只，SPF級，體質量215～245 g，由中國醫學科學院生物醫學工程研究所提供。

1.1.2 毫針 不銹鋼毫針：蘇州東邦醫療器械有限公司。

1.1.3 試劑與儀器 原位細胞檢測試劑盒：美國ROCHE公司（貨號：11684817910）；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒：美國BD公司（貨號：556547）；流式細胞儀：美國BD公司accuri C6型。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 大鼠按隨機數字表隨機分為假手術組、模型組和針刺組。針刺組和模型組又按照隨機數字表將其隨機各分為4個亞組，每亞組均為15只，共60只；假手術組為15只。實驗過程中，共有10只大鼠因死亡而被剔除：假手術組1只；3 h模型組2只，9 h模型組1只，24 h模型組2只，48 h模型組2只；9 h針刺組1只，24 h針刺組1只。

采用Wistar大鼠尾狀核自體血緩慢注入法制作腦出血模型。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（300 mg/kg），先使生理鹽水濕潤大鼠頭部兩耳間毛，后用刀片將其刮去。備皮后將大鼠以俯臥位固定在單臂腦立體定位儀上，參照《大鼠腦立體定位圖譜》[16]定位，前、后囟在同一水平面，然后將其門齒固定于門齒鉤上，同時調整好耳桿及儀器坐標。頭部正中縱行切口，暴露前囟和冠狀縫，在冠狀縫前2 mm、中線右旁開4 mm處用直徑1 mm手鉆人工鉆開顱骨，將25 μL微量進樣器針頭插在腦內6 mm至尾狀核處，緩慢（5 min）注入25 μL自體全血（斷尾，輕輕捋尾，用抗凝管取血），留針5 min后退針。最后用無菌骨蠟封閉鉆孔并縫合頭皮，再用碘伏消毒液消毒創口。大鼠麻醉術后蘇醒，造模成功（預實驗結果采用Bederson評分法[17]和Longa評分法[18]評定行為學變化已經證實），歸籠飼養。Bederson評分法：輕抓大鼠尾巴，提起大鼠高于桌面10 cm，正常大鼠前爪伸直，0分：沒有神經功能缺損；1分：腦部病變對側腕關節、肘關節屈曲，肩內收屈曲；2分：上述體征陽性，向麻痹側推阻力下降；3分：活動時向麻痹側打圈（呈追尾狀）。Longa評分法：0分：沒有神經功能缺損；1分：癱瘓側前爪不能完全伸展；2分：行走時，大鼠向癱瘓側轉圈；3分：行走時，大鼠身體向癱瘓側傾倒；4分：不能自發行走，有意識喪失。評分在1分以上（包括1分）即為造模成功。模型組及針刺組復制腦出血模型，假手術組模擬手術創傷過程于尾狀核注入相同體積生理鹽水。

1.2.2 干預方法 針刺組于造模成功后3 h、9 h、24 h、48 h開始針刺，針刺2次/d（間隔6 h），連續針刺5 d后處死；模型對照組亦于造模成功后3 h、9 h、24 h、48 h開始模擬針刺組的捉抓過程，捉抓2次/d，連續捉抓5 d后處死；假手術組于手術后3 h開始模擬針刺組的捉抓過程，捉抓2次/d，連續捉抓5 d后處死。各組大鼠處死后立即斷頭取腦，觀察相應指標。

大鼠腧穴定位根據中國針灸學會實驗針灸研究會制定的《動物針灸穴位圖譜》，針刺組選取雙側內關穴、人中穴。針具選用31號、1.5寸不銹鋼毫針。內關穴運用透刺法，接電針治療儀，選用連續波，留針1 min；人中穴應用雀啄法強行刺激10次，不留針。

1.2.3 檢測指標與方法 腦組織細胞凋亡率測定分別應用TUNEL法及流式細胞術。

1.3 統計學方法 所得數據采用SPSS 17.0軟件進行處理，定量分析應用單因素方差分析（One-way ANOVA），等級評估采用秩和檢驗（Wilcoxon）。數據均以平均值±標準差（±s）進行表示。顯著性水準為α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TUNEL細胞凋亡檢測 若將組間數據進行比較，假手術組TUNEL陽性細胞率最低；與假手術組比較，同時間模型組和針刺組的TUNEL陽性細胞率明顯增高，尤其是同時間模型組增高最明顯，假手術組、同時間模型組、同時間針刺組3者比較，差別皆有統計學意義（P<0.05）。針刺各亞組之間為48 h針刺組TUNEL陽性細胞率最高，與其余各亞組比較，差別均有統計學意義（P<0.05）；9 h針刺組較之24 h針刺組，差異無統計學意義（P>0.05）；而3 h針刺組分別較9 h針刺組及24 h針刺組的TUNEL陽性細胞率明顯降低，且差異有統計學意義（P<0.05）。見表1、圖1。

在高倍鏡下，大鼠腦出血急性期血腫周圍腦組織TUNEL染色陽性細胞的胞核被染為棕褐色，且形態、大小各異，另有少量胞核被淡染為棕黃色，其以散在的形式不均勻地分布于正常細胞之間。假手術組偶見陽性細胞；模型各亞組陽性細胞顯著增多；針刺各亞組陽性細胞較假手術組仍增多，但較之對應時間點模型各亞組顯著減少。見圖2。

2.2 流式細胞術檢測 假手術組細胞凋亡率最低；與其相比，同時間模型組的細胞凋亡率明顯增高，差異有統計學意義（P<0.05）；相對而言，同時間針刺組的細胞凋亡率也較高，唯有24 h針刺組、48 h針刺組2者分別與假手術組比較，差異有統計學意義（P<0.05），而3 h針刺組和9 h針刺組2者分別與假手術組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；針刺組各亞組與同時間模型組比較，細胞凋亡率顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05）。針刺各亞組之間為24 h針刺組和48 h針刺組細胞凋亡率較高，但2者之間差異無統計學意義（P>0.05），3 h針刺組和9 h針刺組細胞凋亡率較低，且2者分別與24 h針刺組、48 h針刺組比均，差異有統計學意義（P<0.05），3 h針刺組、9 h針刺組2者之間差異無統計學意義（P>0.05）。見表2、圖3、圖4。

3 討論

在腦出血發生后的急性期，腦細胞即會進入細胞凋亡的起始階段，包括外始式和內始式2種途徑[19]。現普遍認為，外始式途徑又被稱為外源性死亡受體途徑，它始于腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）受體家族與配體的結合。當腦組織缺血缺氧時，其相應配體如凋亡相關因子配體（Fas ligand，Fas-L）和TNF等皆上調[20]，引發半胱天冬酶原-8（Procaspase-8）通過高密度自催化激活自身產生半胱天冬酶-8（Caspase-8），后隨即誘導Caspase級聯反應[21]。內始式途徑亦被稱為內源性線粒體途徑，它源于腫瘤抑制基因如p53，當細胞DNA受到損傷時會被激發，此時p53表達并誘發對細胞凋亡前產生作用的Bcl-2家族成員如Bax等的表達上調及Bcl-2等的表達下調，它們共同作用于細胞線粒體，導致線粒體內外膜間物質細胞色素C釋放至細胞質[22]。繼而在細胞質中由細胞色素C、凋亡蛋白酶激活因子（Apoptosis protease-activating factor-1，Apaf-1）及Procaspase-9共同組成的凋亡復合體形成，即Caspase-9的激活狀態，后誘導Caspase級聯反應[23]。在細胞凋亡的效應階段，Caspase-3等蛋白酶是整個過程的主要誘導物，它們受上一階段2種途徑已活化的Caspase-8或Caspase-9誘導激活，通過降解細胞骨架和DNA片段等方式最終導致細胞的死亡[24]。

許多研究已證明，針刺對于細胞凋亡及其百分率具有良好的抑制作用。Feng R等[25]對電針應用到缺血性腦卒中時所發揮的神經保護作用進行了綜述和總結，闡明電針能夠減少腦卒中后所帶來的腦損傷，同時可以在腦卒中未發病時誘導發生腦缺血耐受，而這些積極作用是通過促進血管生成、減輕炎性反應、調節BBB、抑制細胞凋亡等多方面機制來實現的。Hou X等[26]通過動物實驗從腦細胞凋亡角度探討了同時針刺百會穴與大椎穴對于海洛因復吸的影響，結果表明：經過針刺干預后，所觀察的海馬和額葉區域病理損傷明顯減輕，同時Bcl-2表達上調、Bax表達下調，可見針刺發揮了類似西藥美沙酮的效果。由此得出結論，同時針刺百會穴與大椎穴可以預防海洛因復吸大鼠的腦細胞凋亡。李占標等[27]觀察了針刺療法對局灶性腦缺血大鼠大腦皮質蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）表達的影響，探討了針刺療法對局灶性腦缺血大鼠的神經保護機制。實驗結果顯示，針刺能夠降低局灶性腦缺血大鼠缺血側大腦皮質的細胞凋亡率，提高大腦皮質PKA陽性細胞表達率，促進神經修復與再生，從而降低神經性為缺損評分，改善受損神經功能。吳生兵等[28]研究并觀察了電針對腦心綜合征大鼠血腫周圍腦組織細胞凋亡和caspase-3表達的影響情況。通過實驗結果得出結論：電針能夠有效地抑制腦心綜合征大鼠血腫周圍的腦細胞凋亡，其機制可能和下調病灶周圍Caspase-3的表達相關。

郭曉紅等[29]應用Annexin V/PI流式細胞分析法與TUNEL法2種方法對肝細胞的凋亡進行了對比性研究，發現：前者的特異性高，而后者的靈敏度高，因此將二者結合起來檢測細胞凋亡更加準確。本實驗TUNEL結果證明，腦出血后的急性期，血腫周圍腦組織中凋亡細胞及其百分率顯著增高，經增加針刺治療后，雖較假手術后同時間開始干預的凋亡細胞及其百分率仍偏高，但與腦出血急性期同時間即單行捉抓干預比較仍有明顯降低的趨勢，且腦出血3 h開始結合針刺治療的凋亡細胞及其百分率最低。流式細胞檢測也再一次地驗證了這個結果：結合針刺后，細胞凋亡率與腦出血急性期同時間即單行捉抓干預比較有降低明顯，且腦出血3 h或9 h即開始配合針刺細胞凋亡率相對最低，療效幾近于假手術組。由此可見，該實驗中TUNEL結果與流式細胞檢測基本一致。提示針刺治療能夠改善腦出血急性期所造成的血腫周圍腦組織相關的凋亡情況，從而在腦出血急性期起到保護腦組織的作用，且腦出血發生后針刺干預越早療效越好。

參考文獻

[1]Kerr JF，Wyllie AH，Currie AR.Apoptosis：a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics[J].Br J Cancer，1972，26（4）：239-257.

[2]Bae JH，Shim JH，Cho YS，et al.Chemical regulation of signaling pathways to programmed necrosis[J].Arch Pharm Res，2014，37（6）：689-697.

[3]Warner BW.Adaption：paradigm for the gut and an academic career[J].J Pediatr Surg，2013，48（1）：20-26.

[4]Krüger K，Mooren FC.Exercise-induced leukocyte apoptosis[J].Exerc Immunol Rev，2014，20（20）：117-34.

[5]MacKenzie SH，Clark AC.Death by caspase dimerization[J].Adv Exp Med Biol，2012，747（747）：55-73.

[6]Kim YE，Ahn JH.Positive Role of Promyelocytic Leukemia Protein in Type Ⅰ Interferon Response and Its Regulation by Human Cytomegalovirus[J].Plos Pathog，2015，11（3）：e1004785.

[7]Pitrak DL，Novak RM，Estes R，et al.Short Communication：Apoptosis Pathways in HIV-1-Infected Patients Before and After Highly Active Antiretroviral Therapy：Relevance to Immune Recovery[J].AIDS Res Hum Retroviruses，2015，31（2）：208-216.

[8]Venkatraman B，Klenova E，et al.Role of CTCF poly（ADP-Ribosyl）ation in the regulation of apoptosis in breast cancer cells[J].Indian J Med Paediatr Oncol，2015，36（1）：49-54.

[9]Al Gadban MM，Alwan MM，Smith KJ，et al.Accelerated vascular disease in systemic lupus erythematosus[J].Clin Immunol，2015，157（2）：133-144.

[10]Wendling D，Abbas W，Godfrin-Valnet M，et al.Dysregulated Serum IL-23 and SIRT1 Activity in Peripheral Blood Mononuclear Cells of Patients with Rheumatoid Arthritis[J].Plos One，2015，10（3）：e0119981.

[11]Zhou L，Deng L，Chang NB，et al.Cell apoptosis and proliferation in rat brains after intracerebral hemorrhage：role of Wnt/β-catenin signaling pathway[J].Turk J Med Sci，2014，44（6）：920-927.

[12]Shen L，Yang W，Yin JS，et al.Nine-month Angiographic and Two-year Clinical Follow-up of Novel Biodegradable-polymer Arsenic Trioxide-eluting Stent Versus Durable-polymer Sirolimus-eluting Stent For Coronary Artery Disease[J].Chin Med J（Engl），2015，128（6）：768-773.

[13]Hirsova P，Gores GJ，et al.Death Receptor-Mediated Cell Death and Proinflammatory Signaling in Nonalcoholic Steatohepatitis[J].Cell Mol Gastroenterol Hepatol，2015，1（1）：17-27.

[14]Okiyama.Mucocutaneous diseases and murine models with death of keratinocytes induced by lichenoid tissue reaction/interface dermatitis[J].Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi，2015，38（1）：1-7.

[15]胡野，凌志強，單小云.細胞凋亡的分子醫學[M].北京：軍事醫學科學出版社，2002：62-67，221-236.

[16]包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜[M].北京：人民衛生出版社，1991：1-2.

[17]Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke，1986，17（3）：472-476.

[18]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats[J].Stroke，1989，20（1）：84-91.

[19]Hasegawa Y，Suzuki H，Sozen T，et al.Apoptotic mechanisms for neuronal cells in early brain injury after subarachnoid hemorrhage[J].Acta Neurochir Suppl，2011，110（Pt 1）：43-48.

[20]Martin-Villalba A，Herr I，Jeremias I，et al.CD95 ligand（Fas-L/APO-1L）and tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand mediate ischemia-induced apoptosis in neurons[J].J Neurosci，1999，19（10）：3809-3817.

[21]Badiola N，Malagelada C，Llecha N，et al.Activation of caspase-8 by tumor necrosis factor receptor 1 is necessary for caspase-3 actvation and apoptosis in oxygen-glucose deprived cultured cortical cells[J].Neurobiol Dis，2009，35（3）：438-447.

[22]Xie MJ，Ma YH，Miao L，et al.Emodin-provoked oxidative stress induces apoptosis in human colon cancer HCT116 cells through a p53-mitochondrial apoptotic pathway[J].Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（13）：5201-5205.

[23]Marek .The role of the apoptosome in the activation of procaspase-9[J].Postepy Hig Med Dosw（Online），2013，67（863688）：54-64.

[24]Tian HY，Li ZX，Li HY，et al.Effects of 14 single herbs on the induction of caspase-3 in tumor cells：a brief review[J].Chin J Integr Med，2013，19（8）：636-640.

[25]Feng R，Zhang F.The neuroprotective effect of electro-acupuncture against ischemic stroke in animal model：a review[J].Afr J Tradit Complement Altern Med，2014，11（3）：25-29.

[26]Hou X，Zhang R，Lv H，et al.Acupuncture at Baihui and Dazhui reduces brain cell apoptosis in heroin readdicts[J].Neural Regen Res，2014，9（2）：164-170.

[27]李占標，劉方銘，劉維菊.針刺療法對局灶性腦缺血大鼠神經功能、大腦皮層蛋白激酶A表達及細胞凋亡率的影響[J].針刺研究，2013，38（2）：106-111.

[28]吳生兵，何光遠，周美啟，等.電針對腦心綜合征大鼠腦組織細胞凋亡及Caspase-3表達的影響[J].中國中西醫結合雜志，2012，32（5）：639-642.

[29]郭曉紅，劉立新.Annexin V/PI流式細胞分析法和TUNEL法檢測肝細胞凋亡的對比研究[J].山西醫科大學學報，2008，39（5）：476-479.