HPLC法測定含黃芪中藥制劑中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量

陳莉 王盛 孟楣

摘 要 目的：建立一種測定含黃芪中藥制劑中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的方法。方法：以我院中藥制劑養肝益水顆粒為模型藥物，參照2015年版《中國藥典》（一部）（簡稱“藥典”）中“黃芪”項下毛蕊異黃酮葡萄糖苷高效液相色譜（HPLC）含量測定方法，采用藥典色譜條件并在此基礎上，通過增加流動相甲酸比例、延長流動相大極性段洗脫時間等方法進行優化改進，建立含黃芪中藥制劑中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定方法，并進行方法學考察。然后用另外2種含黃芪的中藥制劑對該法進行初步驗證。結果：在藥典色譜條件下，模型藥物中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷色譜峰不能與基線分離；優化后，得到流動相為乙腈-0.2%甲酸溶液（14 ∶ 86，V/V），檢測波長為260 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min的色譜條件。優化條件下毛蕊異黃酮葡萄糖苷質量濃度線性范圍為5.08～81.28 μg/mL；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD均<2.0%（n=6）；平均加樣回收率為100.22%（RSD=0.95%，n=6）。經該法測定的5批模型藥物中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均含量為0.014 2%。經驗證，該法也可有效分離另外2種含黃芪中藥制劑中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷。結論：成功建立測定含黃芪中藥制劑中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的 HPLC法，且該法準確可靠，重現性好，具有一定適用性，可為后續深入研究奠定基礎。

關鍵詞 含黃芪中藥制劑；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；高效液相色譜法；含量測定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the content determination of calycosin glycoside in TCM preparation containing Astragalus membranaceus. METHODS： Using TCM preparation Yanggan yishui granules as model drug in our hospital， referring to HPLC method for content determination of calycosin glycoside stated in terms of “A. membranaceus” of 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia （part Ⅰ） （called “pharmacopoeia” for short）， use pharmacopoeia chromatogram condition and on this foundation to optimize and improve which by the method of increasing the formic acid proportion of mobile phase and prolonging the gradient elution time of the high polar segment of the mobile phase； the method was established for content determination of calycosin glycoside in TCM preparation containing A. membranaceus. Preliminary verification was carried out by using other two kinds of TCM preparation containing A. membranaceus. RESULTS： Under the chromatographic condition of pharmacopoeia， chromatographic peaks of calycosin glycoside in model drug could not be separated from the baseline. Optimized chromatographic condition included that mobile phase was acetonitrile-0.2% formic acid solution （14 ∶ 86， V/V）； the detection wavelength was 260 nm； the column temperature was set at 30 ℃； the flow rate was 1.0 mL/min. Under optimal conditions， the linear range of calycosin glycoside was 5.08-81.28 μg/mL. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2.0% （n=6）. Average recovery was 100.22%（RSD=0.95%，n=6）. Average content of calycosin glycoside in 5 batches of model drugs by this method was 0.014 2%. After validation， the method could effectively isolate calycosin glycoside from other 2 kinds of TCM preparations containing A. membranaceus. CONCLUSIONS： Established HPLC method can be used for content determination of calycosin glycoside in TCM preparations containing A. membranaceus. The method is accurate， reliable， reproducible and suitable， which lays the foundation for further research.

KEYWORDS TCM preparation containing Astragalus membranaceus； Calycosin glycoside； HPLC method； Content determination

毛蕊異黃酮葡萄糖苷為黃芪的主要活性成分，具有免疫調節、抗腫瘤、抗突變、抗損傷、抑制動脈粥樣硬化等多方面作用[1-3]。在2015年版《中國藥典》（一部）（簡稱“藥典”）中“黃芪”項下收載了毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷的含量測定方法，黃芪甲苷常使用蒸發光散射器進行檢測，但檢測基線波動較大，影響試驗結果的準確性。毛蕊異黃酮葡萄糖苷有共軛基團，紫外有吸收，常使用紫外檢測器檢測，其最大吸收波長為260 nm，靈敏度高。因此，常將毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為黃芪含量測定的指標。

有相關研究也報道了毛蕊異黃酮苷的含量測定方法[3-10]，但是大多都是參考藥典中“黃芪”項下毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定的梯度洗脫法。由于毛蕊異黃酮葡萄糖苷出峰時間太早（約6 min），分離效果差，雖然調整了藥典中的流動相，推遲了毛蕊異黃酮葡萄糖苷的出峰時間[2-10]，可有效分離毛蕊異黃酮葡萄糖苷和雜質成分，但是筆者利用藥典中的方法測定成分復雜的含黃芪中藥制劑中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量時，其分離效果欠佳。

因此，筆者選擇我院制備的以黃芪為君藥的中藥制劑——養肝益水顆粒為模型藥物，藥典中“黃芪”項下毛蕊異黃酮葡萄糖苷的色譜條件為基礎，通過增加甲酸比例、延長流動相高極性段洗脫時間等方法優化色譜條件，建立含黃芪中藥制劑中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定方法，并用另外2種含黃芪的中藥制劑對該法進行初步驗證，為后續的深入研究奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

1260高效液相色譜儀、DAD紫外檢測器均購自美國安捷倫科技公司；JA5003N電子天平（上海菁海儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

養肝益水顆粒（批號：20151110、20151214、20160608、20160711、20160801、20160905，規格：10 g/袋）、芪藤消濁顆粒（批號：20160804，規格：10 g/袋）、復方芪薏膠囊（批號：20160808，規格：0.4 g/粒）均由我院制劑中心生產；毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111920-201105，純度：>97.1%）；甲醇、乙腈均為色譜純，水為蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取養肝益水顆粒（批號：20160711）適量，于研缽中研細，精密稱取2 g藥粉，加入圓底燒瓶中；再加入50 mL甲醇并稱質量，于水浴鍋上加熱回流4 h；于室溫下放冷，再稱質量，并用甲醇補足減失的質量，搖勻后濾過，取續濾液25 mL，置于蒸發皿中蒸干，殘渣加甲醇定容至10 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱定毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品6.35 mg，加甲醇定容至50 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.2 優化毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定色譜條件

2.2.1 藥典色譜條件 參考藥典“黃芪”項下毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定的色譜條件[2]。色譜柱為Zorbax Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長為260 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL；流速為1.0 mL/min；乙腈為流動相A，0.2%甲酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0～20 min，20%→40%A；20～30 min，40%A）；對供試品溶液及對照品溶液進行分析。結果，供試品溶液中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷與基線不能分離，需進一步試驗。色譜圖詳見圖1。

2.2.2 藥典色譜條件優化 （1）加大流動相極性。在“2.2.1”項試驗結果的基礎上，增加流動相中甲酸比例以增大流動相極性。同“2.2.1”項下色譜條件以梯度1（0～20 min，15%→40%A；20～30 min，40%A）或梯度2（0～20 min，10%→40%A；20～30 min，40%A）分別進行洗脫。結果，兩種梯度洗脫方法仍不能使毛蕊異黃酮葡萄糖苷與基線分離，但隨著流動相極性的增大，出峰時間有所推遲，從原來的6 min左右推遲到12 min左右，其分離效果相對“2.2.1”項試驗結果有所改善，但仍需進一步試驗。兩種梯度洗脫后供試品溶液的色譜圖見圖2（對照品溶液色譜圖略）。（2）延長流動相大極性段洗脫時間。在加大流動相極性的基礎上，延長流動相中較大極性階段的洗脫時間。①洗脫時間延長5 min，洗脫梯度為（0～5 min，15%A；5～30 min，15%→40%A；30～40 min，40%A）；②洗脫時間延長10 min，洗脫梯度為（0～10 min，15%A；10～30 min，15%→40%A；30～40 min，40%A）；③洗脫時間延長20 min，洗脫梯度為（0～20 min，15%A；20～30 min，15%→40%A；30～40 min，40%A）。以上述3種梯度洗脫條件，分別進行試驗。結果，供試品溶液色譜圖詳見圖3（對照品溶液色譜圖略）。

由圖3A、B可知，流動相中大極性階段的等度洗脫時間越短，基線坡度越大，使得毛蕊異黃酮葡萄糖苷與基線不分離，且其左右干擾峰仍明顯存在。將流動相大極性段等度洗脫時間延長至20 min時，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在15 min左右出峰，且左邊僅1個干擾峰（見圖3C）；說明流動相以15%A等度洗脫時對毛蕊異黃酮葡萄糖苷分離效果更佳。

2.2.3 流動相等度洗脫試驗 在“2.2.2”項試驗結果的基礎上，為了去除毛蕊異黃酮葡萄糖苷左邊干擾峰，試驗在“2.2.1”項下色譜條件下，調整流動相比例至乙腈-0.2%甲酸溶液（14 ∶ 86，V/V），進行試驗。結果，毛蕊異黃酮葡萄糖苷與雜質峰能夠有效分離，色譜圖詳見圖4。因此，確定該條件為毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定的優選色譜條件。

2.3 系統適用性試驗

精密吸取對照品溶液10 μL，以“2.2.3”項優化的色譜條件進樣測定。對照品溶液色譜圖詳見圖5。

結合圖4結果，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計理論板數>3 000，相鄰峰間分離度>1.5，拖尾因子T=0.98（0.952.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線的繪制與線性范圍的考察 取“2.1.2”項下對照品溶液適量，用甲醇定量稀釋成毛蕊異黃酮葡萄糖苷質量濃度分別為5.08、10.16、20.32、40.64、81.28 μg/mL的溶液。分別精密吸取各質量濃度溶液10 μL，注入色譜儀，按“2.2.3”項下色譜條件進行測定，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷的質量濃度為橫坐標（x）、以峰面積為縱坐標（y）作標準曲線，得到回歸曲線方程為：y=29.049 6x-10.814 7（r=0.999 5），表明毛蕊異黃酮葡萄糖苷檢測質量濃度在5.08～81.28 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液10 μL，按“2.2.3”項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖，測定峰面積。結果，毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD=1.24%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取“2.1.1”項下供試品溶液，于室溫放置0、2、4、6、8、10 h后按“2.2.3”項下色譜條件進樣分析。結果，毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD=1.94%（n=6），表明供試品溶液在10 h內穩定性良好。

2.4.4 重復性試驗 取“2.1.1”項下供試品溶液6份，按“2.2.3”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，測定峰面積，并計算毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量。結果，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的RSD=1.42%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.4.5 方法回收率試驗 精密稱取約1 g養肝益水顆粒（批號：20160711）6份，分別加入“2.1.2”項下對照品溶液1.4 mL，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結果，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均加樣回收率為100.22%（RSD=0.95%，n=6），結果詳見表1。

2.5 樣品含量測定

取6批養肝益水顆粒樣品，分別按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液各3份，依次進樣測定，計算毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量。結果，6批樣品的平均含量為0.014 2%，樣品含量測定結果詳見表2。

2.6 驗證試驗

將我院另外2種含黃芪的中藥制劑，利用建立的HPLC法測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量，進行方法驗證。精密稱取芪藤消濁顆粒2 g、復方芪薏膠囊1.2 g，分別按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，以“2.2.3”項優化的色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果，2種含黃芪的中藥制劑的毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰附近無雜質干擾，且基線分離良好；以毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計理論板數均>3 000，相鄰峰間分離度均>1.5，拖尾因子T=1.02（0.95