尼氟酸結腸靶向小球的制備與體外釋藥評價

鄢雪梨 黃仁杰 肖健

摘 要 目的：制備尼氟酸結腸靶向小球，并進行體外釋藥評價。方法：將尼氟酸包載于D-α-維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯（TPGS1000 ）中形成納米膠束，考察尼氟酸納米膠束的包封率、載藥量、粒徑、Zeta電位和多分散系數（PDI）。再采用銳孔-凝固法將納米膠束包裹于低酯果膠中形成尼氟酸結腸靶向小球，觀察尼氟酸結腸靶向小球的外觀形態，計算其粒徑和跨距。比較尼氟酸納米膠束和尼氟酸結腸靶向小球依次在人工胃液（2 h）、人工小腸液（3 h）和人工結腸液（3 h）中的釋藥情況。結果：尼氟酸納米膠束包封率為（93.42±2.33）%、載藥量為（8.54±0.36）%（n=3），粒徑為（25.8±0.6） nm、Zeta電位為（-18.73±0.23） mV（n=20），PDI為0.25。尼氟酸結腸靶向小球外形圓整，表面紋理粗糙，其粒徑為（1.33±0.14） mm（n=3），跨距為0.26。尼氟酸納米膠束在前5 h內的累積釋放度已超過60%，而尼氟酸結腸靶向小球在前5 h內的累積釋放度<30%，二者8 h內的累積釋放度均>80%。結論：該制備方法簡單可行，成功制得具有良好的結腸靶向性能的尼氟酸小球。

關鍵詞 尼氟酸；納米膠束；D-α-維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯；結腸靶向小球；制備；體外釋藥

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare Niflumic acid colon-targeted delivery beads， and to evaluate in vitro drug release. METHODS： Niflumic acid-loaded nanomicelles were prepared with D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate （TPGS1000） as carrier material. Entrapment efficiency， drug-loading amount， particle size， Zeta potential and polydispersity coefficient （PDI） of Niflumic acid-loaded nanomicelles was investigated. The nanomicelles were encapsulated into pectin by using piercing-solidifying method to form Niflumic acid colon-targeted delivery beads. The morphology of Niflumic acid colon-targeted delivery beads was observed， and particle size and span was calculated. The drug release of Niflumic acid-loaded nanomicelles and Niflumic acid colon-targeted delivery beads in artificial gastric juice （2 h）， artificial intestinal fluid （3 h） and artificial colon fluid （3 h） were compared. RESULTS： The encapsulation efficiency of Niflumic acid-loaded nanomicelles was （93.42±2.33）%， drug-loading amount was （8.54±0.36）%； particle size was （25.8±0.6） nm （n=3）； Zeta potential was （-18.73±0.23） mV （n=20）； PDI was 0.25. Niflumic acid colon-targeted delivery beads were round in appearance and rough in texture； the particle size was （1.33±0.14） mm （n=3） and span was 0.26. Accumulative release rate of Niflumic acid-loaded nanomicelles was more than 60% within first 5 h. Accumulative release rate of Niflumic acid colon-targeted delivery beads was lower than 30% within first 5 h， and accumulative release rate were both higher than 80% in 8 h. CONCLUSIONS： The preparation method is simple and reliable. Niflumic acid colon-targeted delivery beads are prepared successfully.

KEYWORDS Niflumic acid； Nanomicelles； D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate； Colon-targeted delivery beads； Preparation； in vitro drug release

尼氟酸（Niflumic acid）又名尼氟滅酸，是一種非甾體抗炎鎮痛藥，臨床上多用于風濕性疼痛等軀體痛的治療，其常用劑型是片劑、膠囊劑、栓劑。近年研究發現，尼氟酸是超極化激活環核苷酸門控陽離子通道2亞型（HCN2）的特異性阻滯藥，能選擇性作用于HCN2 S4電壓敏感區域的外區，從而改變起搏通道的門控作用[1]，而HCN2通道在軀體炎性疼痛與神經病理性疼痛中發揮重要作用[2-3]。同時，有研究發現，HCN2蛋白在腸易激綜合征（IBS）大鼠內臟痛覺相關中樞上的表達顯著增強[4]，呈劑量依賴性抑制其內臟痛覺敏化行為，可提高其內臟痛閾[5]，顯著抑制IBS大鼠海馬突觸長時程增強[6]。這些研究結果均一致表明HCN2可能參與IBS慢性內臟痛覺敏化的形成，提示尼氟酸可能具有改善IBS內臟痛的新作用。

尼氟酸經口服給藥具有一定的胃腸道不良反應及腎臟毒副作用。但口服結腸靶向給藥系統具有定位釋藥特點，可提高藥物的治療效果、減少其副反應[7]。因此口服結腸靶向給藥系統可作為尼氟酸理想的藥物傳遞系統。有研究表明，減小粒徑可使藥物具有炎癥腸道細胞的上皮增強通透性和滯留效應（eEPR）[8-9]，避免腹瀉外排[10]以及多孔性吸附[11]等作用，能有效提高藥物的結腸靶向性。因此，本課題組擬將尼氟酸包載于D-α-維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯（TPGS1000 ）中形成納米膠束，并進一步采用銳孔-凝固法將納米膠束包裹于低酯果膠中形成小球[12]，從而減少尼氟酸納米膠束在胃和小腸中的釋放量，提高制劑的結腸靶向性能。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010A高效液相色譜儀（日本島津公司）； NovaNano-SEM230掃描電鏡和Tecnai G2 20ST透射電鏡（美國FEI公司）；Nicomp 380ZLS粒度檢測分析儀（美國PSS公司）；SCP85H 超速離心機（日本日立公司）；透析袋（北京拜爾迪生物技術有限公司，截留分子量：8 000～14 000 Da）。

1.2 藥品與試劑

尼氟酸對照品（批號：140822，純度：>98%）、TPGS1000（批號：130610）、低酯果膠（批號：141021，酯化度：28%）、聚乙烯亞胺（PEI，批號：140715）、嗜酸性粒細胞陽離子蛋白（ECP，批號：160529）、轉鐵蛋白（TRF，批號：160311）均購自美國Sigma公司；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 尼氟酸結腸靶向小球的制備

2.1.1 尼氟酸納米膠束 按藥載質量比為1 ∶ 10，分別精密稱取尼氟酸和TPGS1000，加入適量甲醇振蕩溶解，于40 ℃下旋轉蒸發除去甲醇，形成均勻薄膜，加入50 mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS），37 ℃下超聲（240 W，40 kHz）振蕩水化至薄膜溶解，再依次用0.2、0.1 μm的聚碳酸酯膜過濾，各重復3次，凍干備用。

2.1.2 尼氟酸結腸靶向小球 在文獻[12]的基礎上，按納米膠束凍干粉與低酯果膠的質量比為1 ∶ 10進行投料，將低酯果膠分次撒入純化水中，溶解制成8%的溶液，再加入尼氟酸納米膠束凍干粉，攪拌混懸均勻，隨即用6號注射針頭將此混合液滴入至緩慢攪拌的10% 氯化鈣溶液中，固化30 min，過濾，于60 ℃烘干，再將小球浸泡在1.0%PEI溶液中，交聯6 h，過濾，純化水洗滌后于60 ℃烘干，即得。

2.2 尼氟酸的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Wondasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.05 mol/L醋酸銨溶液-乙腈（40 ∶ 60，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：288 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL[13]。

2.2.2 線性關系考察 精密稱取尼氟酸對照品適量，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋定容，搖勻，制得質量濃度分別為1.25、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL的系列對照品溶液。按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，得回歸方程為y=2.335x+0.119（r=0.999 5）。結果表明，尼氟酸檢測質量濃度的線性范圍為1.25～50.0 μg/mL。

2.2.3 精密度試驗 取質量濃度為10 μg/mL的尼氟酸對照品溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件，分別于同日內連續進樣測定6次考察日內精密度，每日測定1次，連續測定6 d考察日間精密度。結果顯示，峰面積的日內RSD和日間RSD分別為1.3%和2.1%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.2.4 溶液穩定性試驗 精密量取同一批次的尼氟酸結腸靶向小球適量，加入適量含有2%果膠酶的人工結腸液（pH為6）[12]超聲振蕩10 min，4 000 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min，收集上清液，重復3次，合并上清液，用甲醇定容至50 mL，搖勻，再稀釋10倍制備成供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，分別于0、6、12、24 h進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，峰面積的RSD為1.5%（n=4），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.5 重復性試驗 精密量取同一批次的尼氟酸結腸靶向小球，按“2.2.4”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算含量。結果顯示，尼氟酸結腸靶向小球中尼氟酸平均含量為8.23 mg/g，RSD=1.98%（n=6）。

2.2.6 回收率試驗 精密量取空白小球研磨成細粉，分別精密稱取適量于量瓶中，按尼氟酸最終質量濃度為8、10、12 μg/mL分別加入尼氟酸對照品，每個濃度水平3份，加入適量含有2%果膠酶的人工結腸液（pH為6）超聲振蕩10 min，按“2.2.4”項下方法制備成供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定峰面積，計算加樣回收率。結果顯示，平均加樣回收率為97.67%，RSD=2.53%（n=9），表明該方法準確度較好。

2.2.7 含量測定 取3批尼氟酸結腸靶向小球，研磨成細粉，分別精密稱取0.8 g，各3份，加入適量含有2%果膠酶的人工結腸液（pH為6）超聲振蕩10 min，按“2.2.4”項下方法制備成供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定峰面積，計算含量。結果顯示，樣品中尼氟酸的含量為（8.37±0.24） mg/g（n=3）。

2.3 尼氟酸納米膠束的質量控制

2.3.1 包封率 采用反透析法，精密稱取已知含量的尼氟酸納米膠束，置于50 mL PBS（pH為7.4）中，另將裝有2 mL PBS的透析袋兩端扎緊后置于其中進行反透析，4 h后取袋內的溶液0.5 mL，以甲醇稀釋定容至10 mL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按公式計算包封率（EE）[14]：EE（%）=（ctotal×50-cfree×52）/（ctotal×50）×100%，式中ctotal為尼氟酸納米膠束溶液中的尼氟酸的質量濃度，cfree為游離尼氟酸的質量濃度，50為透析袋外溶液的體積，52為透析袋內外溶液的總體積。結果顯示，尼氟酸納米膠束的包封率為（93.42±2.33）%（n=3）。

2.3.2 載藥量 將“2.3.1”項下經反透析后的膠束溶液進行冷凍干燥，稱其質量M，按公式計算載藥量（LC），LC（%）=（ctotal×50-cfree×52）/（M-cfree×50）×100%。結果顯示，尼氟酸納米膠束的載藥量為（8.54±0.36）%（n=3）。

2.3.3 粒徑和Zeta電位 取適量尼氟酸納米膠束，用純化水稀釋10倍，混勻，經0.22 ?m的微孔濾膜過濾。使用粒度檢測分析儀測定膠束的粒徑和Zeta電位。每個樣品測定20個循環時間，測定溫度設定為25 ℃[15]。結果表明，尼氟酸納米膠束的粒徑較小且分布較窄，平均粒徑為（25.8±0.6） nm、Zeta電位為（-18.73±0.23） mV（n=20），多分散系數（PDI）為0.25，表明尼氟酸納米膠束的分散度良好。尼氟酸納米膠束的粒徑分布圖見圖1。

2.3.4 形態 取適量尼氟酸納米膠束，用純化水進行稀釋，經0.22 μm的微孔濾膜過濾后，將鋪有碳膜的銅網漂放在納米膠束溶液上，1～2 min后取出銅網，用濾紙從銅網邊緣吸干多余液體。將銅網漂放在1%醋酸雙氧鈾染液上約1 min，取出，同樣用濾紙吸干多余液體。室溫放置過夜后，將晾干的銅網放入透射電鏡儀，在加速電壓160 kV下觀察納米膠束外部形態[15]。結果顯示，尼氟酸納米膠束均為球形，外觀圓整，粒徑均一，大約在20～30 nm 之間，粒徑大小與粒度檢測分析儀測得的結果一致。尼氟酸納米膠束的形態見圖2。

2.4 尼氟酸結腸靶向小球的粒徑與形態

隨機抽取100粒尼氟酸結腸靶向小球，分批置于載玻片上，用顯微鏡進行觀察，通過Motic image plus 2.0圖像分析軟件逐一進行粒徑測定（標尺經校正），用Excel 2003軟件計算平均值。經對數正態分布擬合后，求D90、D50、D10，按公式計算跨距（SD）：SD=（D90-D10）/D50。結果顯示，尼氟酸結腸靶向小球的平均粒徑為（1.33±0.14） mm（n=3），跨距為0.26。

另將干燥的尼氟酸結腸靶向小球噴金粉后用導電膠黏在樣品臺上，用掃描電鏡觀察小球形態特征。結果顯示，尼氟酸結腸靶向小球外形圓整，表面紋理粗糙，已形成PEI疏水層。尼氟酸結腸靶向小球的電鏡掃描圖見圖3。

2.5 尼氟酸納米膠束的體外黏附性試驗

參照文獻[16]方法，并進行適當改進。稱取10 mg尼氟酸納米膠束，置于含0.1 mg/mL的ECP和TRF的PBS中，以100 r/min在37 ℃水浴中振蕩，分別于30、60、90、180 min取樣，10 000 r/min（離心半徑10 cm）離心30 min，取上清液適量，經甲醇處理后，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，按公式計算黏附率（MBE）：MBE（%）=（c0-cs）/c0×100%，式中c0為初始尼氟酸的質量濃度，cs為上清液中尼氟酸的質量濃度。結果顯示，尼氟酸納米膠束的黏附率隨時間呈逐漸上升趨勢，最高值達到94.5%，說明該膠束與陽離子蛋白之間有很好的黏附作用。尼氟酸納米膠束的黏附率曲線見圖4。

2.6 尼氟酸結腸靶向小球的溶脹-溶蝕性能

稱取100 mg尼氟酸結腸靶向小球，混懸于裝有人工胃液[pH為1.2，預熱至（37±0.2） ℃]的試管中，將試管置于（37±0.2） ℃恒溫水浴振蕩箱中100 r/min振蕩2 h；之后將介質依次替換為人工小腸液（pH為6.8）、含2%果膠酶的人工結腸液（pH為6），分別振蕩3 h。每隔1 h從試管中取出所有尼氟酸結腸靶向小球，用濾紙吸去其表面多余的水分后稱質量。按公式計算尼氟酸結腸靶向小球的溶蝕率（SER）[17]：SER（%）=（WT-WO）/WO×100%，式中WT為各取樣點尼氟酸結腸靶向小球的質量；WO為初始干燥后尼氟酸結腸靶向小球的質量。結果顯示，尼氟酸結腸靶向小球在人工胃液中吸水膨脹過程緩慢；在人工小腸液中3 h的溶脹達到最大程度，但小球的外觀仍保持完整，未出現明顯的溶蝕現象；而在含果膠酶的人工結腸液中，小球溶蝕率逐漸下降，出現溶蝕現象，提示尼氟酸納米膠束開始從小球中釋放出來。尼氟酸結腸靶向小球的溶脹-溶蝕曲線見圖5。

2.7 體外釋放研究

2.7.1 尼氟酸納米膠束 取已知含量的尼氟酸納米膠束20 mg與2 mL PBS（pH為7.4）混合，裝入預先處理好的透析袋中，并將透析袋置于人工胃液（pH為1.2）中，（37±0.2） ℃恒溫下振蕩（100 r/min）2 h；之后將介質依次替換為人工小腸液（pH為6.8）振蕩3 h和含2%果膠酶的人工結腸液（pH為6）振蕩3 h[12，18]。定時取樣1 mL，并同時補充等溫等量的對應介質，取樣液經0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續濾液經甲醇處理后，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算尼氟酸納米膠中尼氟酸的累積釋放度，并繪制釋藥曲線。結果顯示，尼氟酸納米膠束在前5 h內（人工胃液和人工小腸液）累積釋放度已超過60%，說明該納米膠束在未進入結腸部位前已釋放大部分尼氟酸，結腸靶向性不顯著。

2.7.2 尼氟酸結腸靶向小球 稱取適量的尼氟酸結腸靶向小球按“2.7.1”項下方法依次置于人工胃液、人工小腸液、含2%果膠酶的人工結腸液中，同法處理，計算尼氟酸結腸靶向小球中尼氟酸的累積釋放度。結果顯示，尼氟酸結腸靶向小球在人工胃液和人工小腸液中釋藥緩慢，且累積釋放度低于30%，說明尼氟酸納米膠束得到較好的保護，沒有釋放出大部分的尼氟酸；而在含果膠酶的人工結腸液中，小球溶脹之后釋藥加快，3 h后基本釋藥完全，累積釋放度大于80%，說明小球包載尼氟酸納米膠束之后明顯提高了藥物的結腸靶向性。尼氟酸納米膠束和尼氟酸結腸靶向小球的體外釋放曲線見圖6。

3 討論

TPGS1000在水溶液中能自發聚集形成膠束，其具有的芳香環結構有利于形成較大的膠束疏水核空間，不僅能有效提高難溶性藥物的溶解度，而且對藥物有較高的包封率和載藥量。此外，結腸炎癥組織存在大量帶正電荷的嗜酸性粒細胞陽離子蛋白和轉鐵蛋白[17]，以帶有負電性的TPGS1000作為載體材料的膠束可通過靜電作用而黏附于結腸炎癥組織，可延長藥物在病灶區的滯留時間。體外黏附性試驗結果亦初步證實這一想法，進一步的體內黏附性實驗將在后續試驗中開展。

尼氟酸納米膠束在胃腸道中的大量水分和酶類物質的作用下，可能發生納米膠束的結構破壞或表面電荷改變等不穩定現象。為此，課題組進一步將尼氟酸納米膠束包裹在以低酯果膠為載體的小球中，在胃腸道中發揮保護作用，而結腸部位的果膠酶促進小球降解釋放出納米膠束。

考慮到本試驗中對制劑的包封率和載藥量起到關鍵作用的是納米膠束的制備過程，因此，本文僅針對尼氟酸納米膠束進行這2個指標的評價。此外，所設計的制劑中藥物釋放分為2個階段，在經過胃腸道到達結腸部位后，首先以納米膠束的形式從結腸靶向小球中釋放，而后游離的尼氟酸再從納米膠束釋放出來，試驗結果表明符合預期。課題組將進一步開展該制劑在動物體內的藥動學過程與藥效學研究。

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（收稿日期：2018-01-15 修回日期：2018-06-07）

（編輯：鄒麗娟）