Box—Behnken設計—響應面法優化山楂的醇沉工藝

萬丹娜 饒倩如 俞夢瑩 劉榮華 權赫秀 楊明 邵峰

摘 要 目的：優化山楂的醇沉工藝，為含山楂制劑生產過程中的質量控制提供參考。方法：通過Plackett-Burman設計考察攪拌速度、加醇速度、醇沉時間、加入乙醇體積分數、醇料比、醇沉前濃縮液密度和靜置溫度等工藝參數對山楂總黃酮保留率的影響，然后采用Box-Behnken響應面法對關鍵工藝參數進行優化，并進行驗證試驗。結果：山楂醇沉關鍵工藝參數最優值為醇沉前濃縮液密度1.04 g/mL、醇料比2.86 ∶ 1（mL/g）、攪拌速度185 r/min。經驗證，最優工藝參數下山楂總黃酮平均保留率為89.74%（n=3），與預測值91.40%的相對誤差為1.85%。結論：運用Box-Behnken響應面法優化了山楂的醇沉工藝，該法簡單、可行。

關鍵詞 山楂；醇沉工藝；總黃酮；Plackett -Burman設計；Box-Behnken響應面法

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize the ethanol precipitation technology of Crataegus pinnatifida and provide reference for the production process control of C. pinnatifida preparation. METHODS： Plackett-Burman design was used to investigate the effects of technology parameters on retention rate of total flavonoids of C. pinnatifida， such as stirring speed， flow speed of ethanol， ethanol precipitation time， ethanol volume fraction， ethanol-solid ratio， density of concentration liquid before ethanol precipitation and static temperature. Box-Behnken response surface methodology was used to optimize critical technology parameters， and validation test was also conducted. RESULTS： The optimal key parameters for ethanol precipitation technology of C. pinnatifida included density of concentration liquid before ethanol precipitation 1.04 g/mL， ethanol-solid ratio 2.86 ∶ 1（mL/g）， stirring speed 185 r/min. After validation， under the optimal technology parameters， average retention rate of total flavonoids of C. pinnatifida was 89.74%（n=3）， relative error of which to predicted value 91.40% was 1.85%. CONCLUSIONS： Box-Behnken response surface methodology optimize ethanol precipitation technology of C. pinnatifida. It is simple and feasible.

KEYWORDS Crataegus pinnatifida； Ethanol precipitation technology； Total flavonoid； Plackett-Burman design； Box-Behnken response surface methodology

山楂為薔薇科山楂屬植物山里紅（Crataegus pinnatifida Bge var. major N.E.Br.）或山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）的干燥成熟果實，味酸、甘，性微溫，歸脾、胃、肝經，具有消食健胃、行氣散瘀之功效[1]。山楂含黃酮類、有機酸類、三萜類及氨基酸類等多種化學成分[2]，其中黃酮類成分在抗心肌缺血再灌注損傷[3]、降血脂[4]及抗腫瘤[5]等方面均具有顯著的生物活性。益心舒片（丸、顆粒、膠囊）以及銀丹心腦通軟膠囊、荷丹片等含山楂復方制劑廣泛用于治療冠心病、心絞痛、高血脂等疾病，且上述復方提取物在制劑生產過程中均采用醇沉除雜技術，以實現在確保療效的同時減小服用量。然而，目前在醇沉操作過程中長期依賴主觀經驗，生產企業按各自對制劑“制法”的理解進行工藝參數設定，缺乏科學系統的研究[6]。

近年來，響應面法因其具有試驗次數少、精度高、預測值精準等優點，已廣泛應用于丹參[7]、黨參[8]、六味地黃方[9]及熱毒寧注射液中金銀花和青蒿（金青）[10]等醇沉除雜工藝優化中，并取得了良好的效果。故本研究擬以山楂總黃酮保留率作為考察指標，首先通過Plackett-Burman設計試驗確定攪拌速度、醇料比、醇沉前濃縮液密度等工藝參數，再運用Box-Behnken設計響應面法對山楂醇沉關鍵工藝參數進一步優化，為含山楂制劑醇沉工藝參數的科學設定提供一定的參考。

1 材料

1.1 儀器

UV-2550型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；BT100S型蠕動泵（保定弗雷流體科技有限公司）；JJ-3型恒溫電動攪拌器（常州國華電器有限公司）；BT 124S型萬分之一電子分析天平、BT 25S型十萬分之一電子分析天平[德國賽多利斯（北京）科技有限公司]。

1.2 藥品與試劑

山楂藥材于2016年10月采自山東沂蒙山區，經江西中醫藥大學藥學院劉榮華教授鑒定為山里紅的干燥成熟果實；蘆丁對照品（批號：100396-200301，純度：98%）購于中國食品藥品檢定研究院；其余試劑均為分析純，水為自制雙蒸水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 山楂供試品溶液 稱取2.3 kg的山楂藥材，與水按1 ∶ 8的比例回流提取2次，每次2 h，濾過，合并濾液并減壓濃縮，得到山楂濃縮液。將山楂濃縮液置于燒杯中，在攪拌的同時，根據試驗設計中的醇料比勻速加入乙醇溶液，靜置，濾過，得醇沉上清液。取一定量的醇沉上清液減壓旋干，用30%乙醇溶解并定容于10 mL量瓶中，備用。

2.1.2 蘆丁對照品溶液 精密稱取蘆丁對照品4.91 mg，置于10 mL量瓶中，加入30%乙醇溶解并定容至刻度，得質量濃度為0.491 mg/mL的對照品溶液。

2.2 線性關系考察

2.2.1 總黃酮含量檢測波長的選擇 精密吸取一定量的蘆丁對照品溶液和山楂供試品溶液于不同10 mL量瓶中，加入5% NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置5 min；加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，靜置5 min，然后加入4%NaOH溶液4.0 mL，最后用30%乙醇定容至刻度，靜置15 min。以相應試劑做空白，按文獻方法[11-12]顯色后，于300～800 nm波長下掃描。結果表明，溶液吸光度在508 nm波長處較大且無干擾，故選擇508 nm為測定總黃酮含量的檢測波長。紫外-可見光譜圖見圖1。

2.2.2 標準曲線的繪制及線性范圍考察 分別精密吸取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL蘆丁對照品溶液于10 mL量瓶中，按“2.2.1”項下方法處理后，采用紫外-可見分光光度計測定各樣品在508 nm波長處的吸光度。以蘆丁對照品溶液的質量濃度為橫坐標（x）、吸光度為縱坐標（y）繪制標準曲線，得到回歸方程為y=9.430 6x-0.0146（r=0.999 6），蘆丁檢測質量濃度線性范圍為0.014 73～0.044 19 mg/mL。

2.3 方法學驗證

2.3.1 精密度 精密吸取“2.1.2”項下蘆丁對照品溶液0.6 mL，按照“2.2.2”項下方法操作測定吸光度，重復測定6次。結果，吸光度的RSD為0.106%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性 按照“2.1.1”項方法平行制備6份山楂供試品溶液，按照“2.2.2”項下方法操作測定吸光度。結果，吸光度的RSD為1.08%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.3.3 穩定性 精密吸取山楂供試品溶液適量，按照“2.2.2”項下方法操作，考察室溫條件下放置120 min內的穩定性（每20 min測定1次）。結果，吸光度的RSD為2.64%（n=7），表明山楂供試品溶液在室溫條件下放置120 min穩定性良好。

2.3.4 加樣回收率 精密稱取已知總黃酮含量的山楂藥材10.0 g，共6份，分別按“2.1.1”項下方法制備山楂供試品溶液。精密吸取一定量的山楂供試品溶液于10 mL量瓶中，分別加入一定量的蘆丁對照品溶液，按照“2.2.2”項下方法操作后測定吸光度，并計算加樣回收率。結果，平均加樣回收率為95.8%，RSD為2.80%（n=6），表明方法準確度較好。

2.4 總黃酮含量的測定

取“2.1.1”項下山楂供試品溶液適量，按“2.2.2”項下方法處理后，分別測定醇沉前濃縮液和醇沉上清液中總黃酮含量，計算總黃酮保留率：總黃酮保留率（%）=醇沉上清液中總黃酮含量/醇沉前濃縮液中總黃酮含量×100%。

2.5 Plackett-Burman試驗篩選條件

以總黃酮保留率為考察指標，采用Plackett-Burman試驗對影響醇沉工藝的因素——攪拌速度（A）、加醇速度（B）、醇沉時間（C）、加入乙醇體積分數（D）、醇料比（E）、醇沉前濃縮液密度（F）及靜置溫度（G）等進行篩選，確定主要影響因素。根據前期單因素試驗結果，每個因素設計高、低兩個水平，分別以1、-1表示。因素與水平見表1，試驗設計與結果見表2，方差分析結果見表3。

根據表2結果，通過Minitab 17.0軟件對各因素與總黃酮保留率的關系進行擬合，得到回歸方程為：Y[總黃酮保留率（%）]=75.33+4.73A-2.16B-1.45C-1.23D+4.63E-12.32F-0.73G（R2=0.959 9），模型的P<0.05，表明回歸方程擬合度好且具有統計學意義。由表3可知，A、E、F 3個因素對總黃酮保留率均有顯著影響（P<0.05），影響大小依次為F>A>E，其他因素的影響則不顯著（P>0.05）。故確定攪拌速度、醇料比、醇沉前濃縮液密度3個因素為山楂醇沉的關鍵工藝參數。

2.6 Box-Behnken設計-響應面法優化關鍵工藝因素

2.6.1 試驗設計與結果 在Plackett-Burman試驗研究基礎上，以總黃酮保留率為考察指標，運用Box-Behnken設計-響應面法進一步對攪拌速度（X1）、醇料比（X2）和醇沉前濃縮液密度（X3）這3個關鍵工藝參數進行優化。通過Design-Expert 8.0軟件得到15個試驗點的響應面分析試驗，每個因素共設計高、中、低3個水平，分別用1、0、-1表示。因素與水平見表4，試驗設計與結果見表5，方差分析結果見表6。

通過Design-Expert 8.0軟件對表5結果進行分析，得到各因素與總黃酮保留率（Y，%）之間的回歸擬合方程為：Y=2.04X1+5.67X2-12.19X3-1.94X1X2-0.012X1X3+1.01X2X3-2.08X12-2.08X22-0.90X32+78.15（R2=0.959 9）。由表6可知，該模型的P<0.01，表明回歸方程擬合度好且具有統計學意義。模型失擬項的P>0.05，說明未知因素對試驗結果的干擾很小。因素X1對總黃酮保留率具有顯著影響（P<0.05），因素X2、X3對總黃酮保留率具有極顯著影響（P<0.001），其余各項的影響均不顯著（P>0.05），且X1、X2、X3對總黃酮保留率的影響均不具有顯著的交互性（P>0.05）。

2.6.2 響應面優化與結果驗證 采用Design-Expert 8.0軟件進行分析，得到各因素對總黃酮提取率影響的響應面圖，結果見圖2。

由圖2A可知，當X2一定時，總黃酮保留率隨著X1的增加呈現出先增大后減小的趨勢；同樣，當X1一定時，總黃酮保留率隨著X2的增加呈現出先增大后減小的趨勢。由圖2B可知可知，當X3一定時，總黃酮保留率隨著X1的增加呈現出先增加后趨于平緩的趨勢；當X1一定時，總黃酮保留率隨著X3的增加呈現出減小趨勢。由圖2C可知，當X2一定時，總黃酮保留率隨X3的增加呈現出減小的趨勢；當X3一定時，總黃酮保留率隨X2的增加呈現出先增加后趨于平緩的趨勢。通過分析3者的交互作用，發現因素X1與X2的相互作用對總黃酮保留率影響最大。

通過Design-Expert 8.0軟件預測得到最佳醇沉工藝參數為醇沉前濃縮液密度1.04 g/mL，醇料比2.86 ∶ 1（mL/g），攪拌速度184.49 r/min，總黃酮保留率預測值為91.40%。結合實際生產條件對該工藝參數進行修正，即醇沉前濃縮液密度1.04 g/mL，醇料比2.86 ∶ 1（mL/g），攪拌速度185 r/min。按修正后工藝條件進行3次驗證試驗，得到總黃酮保留率的平均值為89.74%，與預測值的相對誤差為1.85%，表明該模型優化結果準確、可靠。

3 討論

醇沉工藝因其具有操作過程簡單、溶劑安全性高和除雜效果好等優點被廣泛應用于中藥制劑的生產中，到目前為止，一些新技術（如膜分離[13-14]、絮凝[15]、及高速離心[16]等）也未能將其完全取代，醇沉工藝在制劑純化過程中仍有較為廣泛的應用。因此，系統地開展醇沉工藝優化研究，對中藥資源高效利用與制劑質量提升具有重要的現實意義。

中藥醇沉過程的控制涉及到攪拌速度、加醇速度、醇沉時間、加入乙醇體積分數、醇料比、醇沉前濃縮液密度及靜置溫度等諸多工藝參數。本研究采用Plackett-Burman設計對上述重要醇沉工藝參數進行考察，經方差分析確定攪拌速度、醇料比、醇沉前濃縮液密度是山楂醇沉的關鍵工藝參數。乙醇體積分數的變化對有效成分在上清液中的溶解程度具有重要的作用。另外，在本試驗過程中發現，攪拌速度和醇沉前濃縮液密度均直接影響沉淀物的形態。而沉淀物的形態變化與有效成分包裹、損失程度又有著直接的聯系。為從提取液中盡可能多的得到山楂總黃酮，筆者進一步采用Box-Behnken響應面法對上述3個山楂醇沉關鍵工藝參數進行了優化，通過驗證試驗結果發現，實測值與預測值的相對誤差為1.85%，表明該方法預測性好、精度高，這為含山楂制劑的醇沉工藝研究提供了一定參考。但是，各復方制劑中所用藥材和輔料均有差別，其適用性有待進一步考察。

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（收稿日期：2018-02-01 修回日期：2018-04-17）

（編輯：林 靜）