基于“成分—靶點—通路”網絡模式探討淫羊藿治療骨性關節炎的分子機制

駱帝 許波 李剛 梁學振 蓋帥帥 李嘉程 閻博昭 夏聰敏

摘 要 目的：基于“成分-靶點-通路”網絡模式探討淫羊藿治療骨性關節炎可能的分子機制。方法：通過中藥系統藥理學數據庫和分析平臺，篩選和預測淫羊藿可能的入血活性成分[以藥物動力學參數中的口服藥物生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18進行篩選]和靶點，挖掘疾病相關數據庫中骨性關節炎的作用靶點，采用拓撲分析工具篩選淫羊藿治療骨性關節炎的關鍵靶點，采用ClueGo插件分析其可能的分子機制。結果：檢索出淫羊藿相關成分130個，根據OB和DL值篩選出23個活性成分，同時預測出102個可能的作用靶點，構建了“入血活性成分-疾病靶點”相互關系網絡圖；通過疾病相關數據庫檢索出168個骨性關節炎相關靶點，拓撲分析篩選出185個關鍵節點；ClueGo分析結果顯示，淫羊藿作用于骨性關節炎的關鍵節點涉及的信號通路主要被富集在細胞周期、炎癥及癌癥相關等68條信號通路中；其可能的控制疾病進展的作用機制不僅包括直接參與軟骨細胞的增殖、凋亡及分化，調節骨代謝平衡，還可以通過調節炎癥、免疫等干預和影響骨與軟骨微環境。結論：淫羊藿治療骨性關節炎具有多系統、多成分、多靶點的特點；預測、篩選出的機制與目前治療骨性關節炎的作用機制相符合。

關鍵詞 淫羊藿；骨性關節炎；網絡藥理學；靶點；分子機制；信號通路

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the potential molecular mechanism of Epimedium brevicornu in the treatment of osteoarthritis based on “ingredient-target-pathway” network mode. METHODS： The potential active components in blood [pharmacokinetic parameters as oral drug bioavailability （OB）≥30% and drug-likeness （DL）≥0.18] and target spots of E. brevicornu were screened and predicted by TCM system pharmacology database and analysis platform. The target spots of osteoarthritis were excavated from disease-related database， and key target spots of E. brevicornu in the treatment of osteoarthritis were screened by Topology analysis. The potential molecular mechanism of it was analyzed by using ClueGo analysis. RESULTS： A total of 130 corresponding compounds of E. brevicornu were retrieved in the study； 23 active compounds were screened according to OB and DL value， which predicted 102 potential target spots， the relationship networks of “the active components in blood-disease target” was structured. A total of 168 targets spots related to osteoarthritis were retrieved from disease-related database， and 185 key nodes were screened out by topological analysis. ClueGo analysis showed that signaling pathways involved in the action of E. brevicornu on osteoarthritis were mainly enriched in 68 signaling pathways such as cell cycle， inflammation and cancer related signaling pathways. The potential mechanism is that control the progress of disease to participate in the proliferation， apoptosis and differentiation of cartilage cells directly， regulate bone metabolism balance， and regulate the inflammation system， immune system and etc. to interfere with and influence bone and cartilage microenvironment. CONCLUSIONS： For osteoarthritis， E. brevicornu has the characteristics of multiple systems， multiple targets and multiple components. It is consistent with the current mechanism of osteoarthritis treatment.

KEYWORDS Epimedium brevicornu； Osteoarthritis； Network pharmacology； Target spot； Molecular mechanisms； Signaling pathway

骨性關節炎（Osteoarthritis）是一種由機械性和生物性等因素引起的，以關節軟骨變性、骨質丟失、關節邊緣骨贅形成及軟骨下骨質增生為特征的慢性、漸進性、退行性關節疾病[1]。流行病學研究表明，全世界 50 歲以上人群約有50%患有骨性關節炎，而我國 75 歲以上人群的骨性關節炎患病率高達80%，其致殘率可達53%[2]。目前，骨性關節炎的非手術治療手段有很多[3]，包括藥物干預、飲食調控和運動療法等。采用化學藥治療時藥物通常分為非特異性藥物和特異性藥物兩類，可顯著緩解患者的臨床癥狀，但這些藥物的不良反應和耐受性限制了其應用，而且上述藥物靶向性過于單一，因此，亟需探尋新的思路解決上述問題。傳統中醫憑借其“簡、便、廉、效”的優勢在防治骨性關節炎方面可能具有其獨有的優勢和廣闊的發展前景。

淫羊藿始載于《神農本草經》，歸肝、腎經，可補腎陽、強筋骨、祛風濕，用于陽痿遺精、筋骨痿軟、風濕痹痛及麻木拘攣等[4]。文獻研究表明[5]，淫羊藿對關節軟骨細胞有增殖促進作用，在治療骨性關節炎方面可發揮重要作用，但其藥效物質基礎和分子機制至今尚不明確。因此，分析淫羊藿的有效活性成分，探討其可能的作用機制，對淫羊藿治療作用科學內涵的闡述和臨床應用的推廣具有重要意義。但考慮到中藥的多成分、多靶點、多通路特點，單純依靠現有的技術手段往往難以科學、有效、全面地闡釋中藥的作用機制。

網絡藥理學是基于藥物系統和生物系統的作用模式而提出的一種藥物設計新方法[6]，其為中藥潛在活性成分和作用靶點的進一步研究提供了有效的策略。本研究基于“成分-靶點-通路”網絡模型，科學篩選和系統預測淫羊藿入血活性成分干預骨性關節炎的潛在作用靶點和信號通路，為深入探討淫羊藿治療骨性關節炎的作用機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 數據庫與軟件

網絡圖像化軟件Cytoscape （3.2.1 版）（http：//www.cytoscape.org）；中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）；治療靶點數據庫（Therapeutic Target Database，TTD）（http：//bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp）；藥物銀行（DrugBank）（https：//www.drugbank.ca/）；在線人類孟德爾遺傳數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）（http：//www.omim.org/）；遺傳關聯數據庫（The Genetic Association Database，GAD）（https：//geneticassociationdb.nih.gov/）；藥物遺傳學和藥物基因組學知識庫（Pharmacogenetics and Pharmacogenomics Knowledge Base，PharmGKB）（https：//www.pharmgkb.org/）；蛋白質數據庫（UniProt）（http：//www.uniprot.org/）；京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）（http：//www.genome.jp/kegg/）。

1.2 研究流程

本研究首先通過藥物動力學（Absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME）參數篩選出淫羊藿入血活性成分，隨后利用TCMSP數據庫的靶點預測模型預測出其可能作用的靶點；再由疾病靶點數據庫篩選出骨性關節炎相應靶點；然后，使用相關軟件繪制出蛋白質間相互作用關系，抽取交集并利用相關網絡參數進行拓撲分析，并對最終得到的關鍵靶點進行通路富集分析，以嘗試分析淫羊藿治療骨性關節炎的分子機制，分析流程圖見圖1。

1.3 淫羊藿入血活性成分篩選與ADME參數分析

檢索TCMSP數據庫中淫羊藿所有成分數據，根據成分的ADME參數進行入血活性成分的篩選[7-9]，其中篩選條件[10]為藥物口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18。

1.4 淫羊藿作用靶點預測及“入血活性成分-疾病靶點”網絡構建分析

利用TCMSP 數據庫靶點預測模型對上述入血活性成分的作用靶點進行預測，通過Cytoscape軟件構建“入血活性成分-疾病靶點”網絡圖，其中分子、靶蛋白用“節點”（Node）表示，成分與靶點之間的關系用“邊”（Edge）表示；采用Network analyzer軟件分析網絡特征，明確淫羊藿中起重要作用的入血活性成分和作用靶點，并查閱文獻分析其相互作用關系。

1.5 骨性關節炎相關疾病靶點檢索分析

以“Osteoarthritis”作為關鍵詞檢索TTD、DrugBank、OMIM、GAD、PharmGKB等與疾病靶點相關的數據庫中與骨性關節炎疾病已知的相關靶點。

1.6 淫羊藿治療骨性關節炎的蛋白質-蛋白質相互作用關系的網絡構建與關鍵靶點篩選分析

機體的內在調控往往不是僅僅由單一信號通路支配的，而是由極其復雜的網絡調控的；不同的靶點和信號通路之間會存在不同程度的信號轉導，故藥物作用機制除考慮與成分靶點的直接結合外，還應考慮直接調控靶點與間接調控其他靶點相結合的調控方式。構建與挖掘蛋白質-蛋白質相互作用關系（Protein-Protein Interaction，PPI）數據為尋找靶點的直接、間接調控作用關系提供了可能。

本研究采用的Cytoscape軟件中BisoGenet插件是由Biological General Repository for Interaction Datasets（BioGRID）、Biomolecular Interaction Network Database（BIND）、Molecular Inter-action Database（MINT）、Human Protein Reference Database（HPRD）、Database of Interacting Proteins（DIP）和Biological General Repository for Interaction Datasets（GRID）等6種蛋白質相互作用關系數據庫構成的，用以繪制和分析上述獲得的入血活性成分及疾病靶點的PPI網絡。

利用Cytoscape軟件抽取上述繪制的2個網絡圖的交集網絡，通過網絡拓撲分析插件CytoNCA[11]，借助度中心性（Degree centrality，DC）、介度中心性（Betweenness centrality，BC）、接近中心性（Closeness centrality ，CC）、特征向量中心性（Eigenvector centrality，EC）、網絡中心性（Network centrality，NC）和局部邊連通性（Local average connectivity，LAC）等指標篩選網絡中關鍵基因，以盡可能在網絡中獲得更多節點的傳遞信息和更高的節點信息傳遞效率，充分發揮其在網絡中重要的作用。其中，篩選標準為DC值大于所有節點DC值中位數2倍的節點和其他幾個指標大于所有節點中位數的節點。

1.7 Pathway 富集分析

采用通路富集分析插件ClueGO[12]富集分析上述獲得的關鍵靶點，以節點和餅狀圖的形式展現信號通路富集結果，進一步分析淫羊藿治療骨性關節炎可能的作用機制。其中，同一類型的信號通路用同種圖形的節點代表，信號通路的顯著程度用節點的大小代表，信號通路顯著程度越高節點越大，說明該通路的重要性越高。

2 結果

2.1 淫羊藿入血活性成分篩選與ADME參數分析

通過TCMSP數據庫檢索出淫羊藿的相關成分130個，其中滿足OB≥30%的成分共有45個，滿足DL≥0.18的成分共有91個。根據ADME參數篩選標準，即同時滿足OB≥30%與DL≥0.18的成分共有23個，即篩選出淫羊藿中23個入血活性成分。

2.2 淫羊藿作用靶點預測及“入血活性成分-疾病靶點”網絡構建分析

通過TCMSP 數據庫靶點預測模型，預測獲得23個上述入血活性成分的作用靶點102個；利用Cytoscape軟件繪制入血活性成分與作用靶點關系的網絡圖，結果發現，淫羊藿的入血活性成分與作用靶點存在217個不同程度的相互關系；在上述23個成分中，最終得到與靶點存在相互作用關系的入血活性成分包括茯苓酯、槲皮素等9個化學成分，根據不同靶點與成分對應關系數目分別進行分類展示。靶點對應的成分越多，提示該靶點相對重要性越高。淫羊藿“入血活性成分-疾病靶點” 相互關系網絡圖見圖2。

2.3 與骨性關節炎相關疾病靶點的檢索分析

通過檢索TTD、DrugBank、OMIM、GAD、PharmGKB 等數據庫分別獲得35、1、61、97、2個靶點，刪除重復靶點以納入168個與骨性關節炎發生、發展密切相關的靶點。

2.4 淫羊藿治療骨性關節炎的PPI網絡構建與關鍵靶點篩選分析

2.4.1 淫羊藿治療骨性關節炎的PPI網絡構建分析 通過BisoGenet工具構建淫羊藿入血活性成分的作用靶點PPI網絡圖，發現有6 134個與其產生直接或間接作用的靶點和138 994條靶點與靶點之間的相互關系；與此同時，繪制與骨性關節炎相關的靶點PPI網絡圖，發現有 4 101個與其直接或者間接相關的靶點和97 706條個靶點與靶點之間的相互關系。

2.4.2 淫羊藿治療骨性關節炎的關鍵靶點篩選分析 通過Cytoscape軟件抽取上述繪制的2個PPI網絡圖中的交集網絡，采用CytoNCA拓撲屬性篩選獲得185個關鍵節點。篩選策略示意圖見圖3。

2.5 Pathway 富集分析

通過ClueGO插件對上述185個關鍵節點進行Pathway富集分析發現，淫羊藿作用于骨性關節炎的關鍵節點涉及的信號通路主要與細胞周期、炎癥及癌癥等的68條信號通路相關，主要包括以下幾部分：（1）細胞周期相關通路23條：Wnt、轉化生長因子（TGF）-β、FoxO、低氧誘導因子（HIF）-1α、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Notch、DNA復制、泛素介導的蛋白質水解、卵母細胞減數分裂、粘合連接及凋亡等；（2）炎癥相關通路18條：核轉錄因子（NF）-κB信號通路、白細胞介素（IL）-17信號通路、B細胞抗原受體信號通路及T細胞抗原受體等；（3）癌癥相關信號通路14條：癌癥中轉錄失調、甲狀腺癌、前列腺癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌、胰腺癌及膀胱癌等；（4）其他相關信號通路13條：甲狀腺激素、神經營養因子、乙型肝炎、丙型肝炎及甲型流感等。淫羊藿治療骨性關節炎信號通路富集分析情況見圖4。

3 討論

中醫學中沒有骨性關節炎病名，依據其臨床表現，屬于“骨痹”范疇，其基本病機為經脈瘀阻、腎精虧虛。腎虛是發病之根本，加之氣滯、血瘀、痰凝等因素貫穿始終，腎虛為本，血瘀為標，病程較長，遷延不愈[13]。《素問·五臟生成篇》曰：“骨痹不已，復感于邪，內舍于腎”。中醫學認為“痹者，閉也”，閉阻不通，則發疼痛，即“不通則痛”。《辨證錄》云：“內治之法，必須活血祛瘀為先，血不活則瘀不能去”。《醫學衷中參西錄》言：“補腎之藥，實兼開瘀血之藥”。故治療本病應以補腎為本，配合活血化瘀藥物，從而達到標本兼治的目的[14]。

淫羊藿又稱“三枝九葉草”，屬《神農本草經》中品行列，具有補精壯體的作用，在治療骨性關節炎方面具有較好的療效[15]。本研究通過篩選獲得淫羊藿中入血的活性成分23個，并在此基礎上挖掘出102個可能的靶點和217個相互關系。“入血活性成分-疾病靶點”相互關系網絡圖分析顯示，木犀草素、槲皮素、谷甾醇、山奈酚等有效成分能同時作用于多個靶點，而過氧化物酶體增生因子激活受體（PPARG）、雌激素受體（ESR1）、細胞分裂蛋白激酶（CDK1）等靶點也能與多個成分形成對應關系。基于上述結果可知，淫羊藿的有效成分之間存在協同關系，其調控的靶點也在疾病發生發展中發揮著關鍵作用。

從通路富集結果分析可知，淫羊藿主要通過影響細胞周期、炎癥及癌癥相關等通路而發揮治療骨性關節炎作用。（1）細胞周期相關通路23條。如Wnt、TGF-β、FoxO、HIF-1α、MAPK等，其中Wnt信號通路和TGF-β信號通路均能促進間充質干細胞的更新，在軟骨細胞的增殖、分化中發揮著重要的調節作用[16-17]；而MAPK信號通路可受到生長因子、細胞因子、神經遞質、激素等多種信號分子刺激后發生磷酸化而影響細胞增殖、分化、遷移、凋亡及應激反應等生理過程[18-19]。（2）炎癥相關通路18條。骨性關節炎是在多種因素共同作用下的具有炎癥特性的臨床疾病，關節軟骨的退變既是其啟動因素，又是其主要病理特征，可激活多種炎癥反應的信號轉導過程，故調控其病變周圍的炎癥環境對于疾病的轉歸有著重要意義。其中，NF-κB信號通路及IL-17信號通路與炎癥因子的產生密切相關，參與多種因子的調控作用，進而影響骨性關節炎的重要進程[20-21] ，B細胞抗原受體信號通路的激活往往通過復雜的信號傳遞級聯反應影響細胞代謝、基因表達和細胞骨架組織等過程[22]。T細胞抗原受體信號通路直接調節機體免疫而發揮直接殺傷靶細胞、參加免疫應答及產生細胞因子等多種生物學功能[23]。（3）癌癥相關信號通路14條。癌癥中轉錄失調、甲狀腺癌、前列腺癌、結腸直腸癌等癌癥相關信號通路也被顯著富集，說明疾病之間的調控機制存在相互聯系、相互影響和相互交叉的關系[24]。（4）其他相關信號通路13條。體內代謝之間是相互作用、相互聯系的，通過全身其他系統，如內分泌系統、神經系統等多種代謝可以間接影響或干預骨微環境。所以，在淫羊藿作用靶點網絡集群中還覆蓋了甲狀腺激素、神經營養因子、乙型肝炎、丙型肝炎及甲型流感等信號通路。

綜上所述，淫羊藿作用于骨性關節炎的各作用通路之間相互聯系，既存在相互協同的關系又存在相互拮抗的關系，故針對骨性關節炎的治療不僅要從局部關鍵通路入手，還應考慮疾病病因、所處機體環境的差異進行多靶點、多系統干預，與傳統中醫“治病求本、標本兼治”的治療特點相一致，也進一步說明了中藥多靶點、多方面及多系統干預的可行性和優勢。基于“成分-靶點-通路”的網絡藥理學分析結果能有效地揭示淫羊藿治療骨性關節炎可能的活性成分及作用機制，為后續實驗設計的優化和機制的進一步探討等提供了強有力的理論依據；同時，也為中藥及其復方針對某種特定疾病的機制研究提供了思路和方法。

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（收稿日期：2017-11-15 修回日期：2018-02-09）

（編輯：劉 萍）