濁點萃取結合UPLC—MS/MS法測定氣道炎癥模型豚鼠灌胃射干提取物后血漿中LTB4的濃度

楊瑞 邸子真 吳怡 陶弘武

摘 要 目的：建立測定氣道炎癥豚鼠血漿中白三烯B4（LTB4）濃度的方法，考察給予射干提取物后其對豚鼠血漿中LTB4濃度的影響，為闡明射干提取物抗炎止咳的作用機制提供參考。方法：將30只豚鼠隨機分為空白組、模型組和射干提取物組，每組10只。除空白組外，其余2組豚鼠采用煙熏+合胞病毒滴鼻法制造氣道炎癥模型。造模結束后次日，射干提取物組豚鼠灌胃給藥（10 mg/kg射干提取物，以野鳶尾黃素計），空白組和模型組豚鼠灌胃等體積生理鹽水，每天給藥1次，連續給藥7 d，末次給藥后收集血漿樣品。分別考察表面活性劑Triton X-114濃度、鹽酸濃度、鹽酸加入量、平衡溫度和平衡時間對LTB4提取回收率的影響（以44.5 g/L的牛血清白蛋白生理鹽水溶液替代空白血漿），確定最優濁點萃取工藝進行生物樣品處理。然后以吲哚美辛為內標，采用超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）法測定血漿中LTB4濃度。色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18，流動相為0.2%甲酸水-乙腈（40 ∶ 60，V/V），流速為0.4 mL/min，柱溫為40 ℃，進樣量為5 μL；MS條件：電噴霧離子源，正離子模式下掃描，LTB4用于定量的離子為[M+H]+質荷比（m/z）335.219 4→195.099 8，吲哚美辛為[M+H]+ m/z 356.083 6→312.084 2。結果：濁點萃取最優條件為Triton X-114濃度5%，加入0.3 mol/L鹽酸50 μL調至酸性、平衡溫度50 ℃，平衡時間20 min。在該含量測定條件下方法學驗證結果均符合相關要求。與空白組比較，模型組豚鼠血漿中LTB4濃度顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，射干提取物組豚鼠血漿中LTB4濃度顯著降低（P<0.05）。結論：本研究中樣品處理方法綠色環保，含量檢測方法靈敏度高、準確性好，適用于血漿中LTB4濃度的測定；射干提取物可使氣道炎癥豚鼠血漿中升高的LTB4濃度得到顯著回調。

關鍵詞 濁點萃取；超高效液相色譜-串聯質譜法；射干提取物；白三烯B4；豚鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for determining the concentration of leukotriene B4 （LTB4） in plasma of airway inflammatory guinea pigs， investigate the effects after giving Belamcanda chinensis extract on plasma concentration of LTB4 in guinea pigs and provide reference for clarifying the mechanism of anti-inflammatory and antitussive effects of B. chinensis extract. METHODS： Totally 30 guinea pigs were randomly divided into blank group， model group and B. chinensis extract group， with 10 guinea pigs in each group. Except for blank group， airway inflammation model was induced by smokation+syncytial virus intranasal method in other 2 groups. At next day after modeling， guinea pigs were given relevant medicine （10 mg/kg B. chinensis extract， calculated by irigenin） intragastrically in B. chinensis extract group； blank group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically， once a day， for consecutive 7 d， and the plasma samples were collected after last administration. Then， the effects of surface active agent Triton X-114 concentration， hydrochloric acid concentration， hydrochloric acid amount. Equilibrium temperature and equilibrium time on extraction recovery rate of LTB4 were investigated （using 44.5 g/mL BAS saline solution instead of blank plasma）. The optimal cloud point extraction technology was determined for biological sample treatment. Using indometacin as internal standard， UPLC- MS/MS method was used to determine the concentration of LTB4 in plasma. Chromatographic conditions： the chromatographic column is ACQUITY UPLC BEH C18， the mobile phase is 0.2% formic acid-acetonitrile （40 ∶ 60，V/V）， flow rate is 0.4 mL/min， column temperature is 40 ℃， sample volume is 5 ?L. MS condition： Electrospray ion source， positive ion mode scanning， and the LTB4 used for the [M+H]+ mass ratio （m/z） 335.219 4→195.099 8， Indomethacin is [M+H]+ m/z 356.083 6→312.084 2. RESULTS： The optimal cloud point extraction condition included Triton X-114 concentration 5%， added into 0.3 mol/L hydrochloric acid 50 μL adjusted to acid and equilibrium temperature 50 ℃， for 20 min. The results of methodology validation were all in line with the content determination requirements. Compared with blank group， the plasma concentration of LTB4 in guinea pigs was increased significantly in model group （P<0.05）. Compared with model group， the plasma concentration of LTB4 in guinea pigs was decreased significantly in B. chinensis extract group （P<0.05）. CONCLUSIONS： The method of sample processing is environmental friendly， and the content determination method is high sensitivity and accuracy， and applicable for determination of LTB4 in plasma samples. B. chinensis extract can significantly regulate the increase of LTB4 concentration in plasma of guinea pigs with airway inflammation.

KEYWORDS Cloud point extraction； UPLC-MS/MS； Belamcanda chinensis extract； Leukotriene B4； Guinea pig

隨著綠色化學的發展，生物樣品分析技術逐漸向著不使用或者盡可能少使用有機溶劑的方向發展。目前，在生物樣品的測試過程中，樣品的前處理及分析過程中需要大量的有機試劑，產生了大量的化學污染物。因此，發展“創新、綠色”的生物樣品分析技術成為當前研究的熱點。濁點萃取（Cloud point extraction，CPE）是一種新型的液-液萃取技術，利用非離子表面活性劑的增溶作用和在濁點溫度時兩相分離而達到對待測物分離富集的效果。相比于傳統的生物樣品前處理方法，CPE技術具有萃取效率高、富集因子大、不使用有機溶劑、對環境和操作人員危害小、表面活性劑易于處理、易與其他分析儀器聯用、便于進行大規模操作等優勢[1]。目前，CPE技術已廣泛應用于生物樣品分析領域[2-4]。

白三烯B4（LTB4）是花生四烯酸在脂氧酶代謝途徑中的產物，為變應性疾病發病的關鍵炎癥介質[5-8]，具有強大的細胞趨化作用，可吸引包括淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞在內的多種細胞向炎癥反應部位聚集和激活[9]。前期研究表明[10-12]，射干提取物具有良好的抗炎、止咳多靶標作用，能夠顯著抑制花生四烯酸的脂氧酶和環氧合酶代謝。本研究在此基礎上，采用CPE技術，并結合超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC- MS/MS）法監測射干提取物灌胃給藥后氣道炎癥豚鼠血漿中的LTB4濃度的變化，為射干提取物抗炎、止咳機制研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Xevo G2-XS 超高效液相色譜-飛行質譜聯用（UPLC-QTOF-MS）儀、Masslynx 4.1數據處理系統（美國Waters公司）；XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；XS105分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SIGMA3-18K低溫冷凍高速離心機（德國Sigma公司）。

1.2 藥品與試劑

射干藥材購自湖北射干種植基地，經遼寧中醫藥大學李峰教授鑒定為鳶尾科射干屬植物射干 Belamcanda chinensis （L.） DC.的干燥根莖；LTB4對照品（美國Cayman Chemical公司，批號：0466969-14，純度：≥97.0%）；吲哚美辛對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100258-200904，純度：99.9%）；牛血清白蛋白（北京索萊寶科技有限公司，批號：B0040）；甲醇、乙腈（美國Fisher Scientific公司，質譜純）；表面活性劑曲拉通X-114（Triton X-114，美國Sigma-Aldrich公司）；水為自制超純水。

1.3 病毒

呼吸道合胞病毒購自廣州博特生物有限公司。

1.4 動物

SPF級Hartley豚鼠30只，♂，體質量250～300 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2014-0001。

2 方法與結果

2.1 色譜及質譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 （100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：0.2%甲酸-乙腈（40 ∶ 60，V/V）；流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。

2.1.2 MS條件 電噴霧離子源（ESI），離子源溫度：100 ℃；毛細管電壓：3 kV；錐孔電壓：40 V；脫溶劑氣溫度：350 ℃；錐孔氣流速：50 L/h；脫溶劑氣流速：800 L/h；正離子模式檢測，掃描方式為多反應監測（MRM），掃描時間為0.5 s；LTB4用于定量的離子為 [M+H]+質荷比（m/z）：335.219 4→195.099 8，碰撞能量（CE）：16 V；內標吲哚美辛用于定量的離子為[M+H]+ m/z：356.083 6→312.084 2，CE：9 V。

2.2 溶液的制備

2.2.1 LTB4對照品溶液 精密稱取LTB4對照品10.00 mg于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得1 mg/mL的LTB4儲備液；甲醇逐級稀釋儲備液制成LTB4質量濃度分別為10、20、50、100、200、250、500、800、1 000 μg/L的LTB4系列對照品溶液。其中，20、250、800 μg/L的LTB4溶液為質控（QC）用對照品溶液，其余為標準曲線用對照品溶液。

2.2.2 吲哚美辛內標溶液 精密稱取吲哚美辛對照品11.25 mg于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得1.124 mg/mL的吲哚美辛儲備液；取儲備液再用甲醇稀釋為質量濃度為112.4 μg/L的吲哚美辛內標溶液。

2.3 射干提取工藝

取射干藥材 1 kg，分別加8、6倍量70%乙醇提取2次，分別提取1、0.5 h，濾過，收集上清液并濃縮，減壓干燥，即得射干提取物，出膏率為4.8%（經高效液相色譜法檢測，提取物中含野鳶尾黃素1.88 mg/g）。

2.4 動物模型的建立及血漿樣品的采集

30只豚鼠適應性飼養1 周后隨機分成 3 組，即空白組、模型組和射干提取物組，每組10只。除空白組外，將其余2組豚鼠每日放入自制熏籠中煙熏30 min，連續7 d，分別在第2、3天用乙醚淺麻醉，然后鼻腔滴入合胞病毒液[13]。射干提取物組豚鼠于第8天灌胃給予射干提取物10 mg/kg（以野鳶尾黃素計）[13]，空白組和模型組豚鼠給予相同體積的生理鹽水，連續給藥7 d后腹主動脈采血，以1 370×g離心10 min，分離血漿，保存備用。

2.5 血漿樣品的處理

采用CPE法進行血漿樣品處理。精密吸取100 μL血漿樣品于1.5 mL空白離心管中，加入吲哚美辛內標溶液10 μL、甲醇-水（50 ∶ 50，V/V）10 μL、Triton X-114溶液150 μL和一定濃度的鹽酸溶液適量，渦旋混勻5 min，水浴環境中一定溫度下平衡一定時間后，取出，以1 370×g離心5 min，棄去水相，向表面活性劑層中加入乙腈100 μL，渦旋混勻，以13 148×g離心5 min，取上清液進樣分析。

2.6 血漿樣品CPE法的條件優選

CPE過程主要受表面活性劑的濃度、樣品酸堿度、平衡溫度和平衡時間的影響[2]。因此，本研究分別考察上述4個因素對LTB4提取回收率的影響，優化樣品CPE處理方法。提取回收率計算公式為：LTB4提取回收率（%）=CPE樣品中LTB4與吲哚美辛的峰面積比/純溶液中LTB4與吲哚美辛的峰面積比×100%。

2.6.1 Triton X-114濃度的考察 在CPE過程中，固定鹽酸的濃度為0.3 mol/L、加入量40 μL，平衡溫度為50 ℃，平衡時間為30 min，分別采用濃度為1%、3%、5%、7%、9%的Triton X-114進行血漿樣品的替代基質（44.5 g/L的牛血清白蛋白生理鹽水溶液）[14]處理。結果表明，當Triton X-114濃度從1%增加到5%時，LTB4的提取回收率逐漸增加且趨于平穩，綜合考慮表面活性劑用量可能對質譜的影響，確定Triton X-114濃度為5%。Triton X-114濃度對LTB4提取回收率的影響結果見圖1A。

2.6.2 樣品酸堿度的考察 在CPE過程中，固定Triton X-114濃度為5%，平衡溫度為50 ℃，平衡時間為30 min，分別考察鹽酸的濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L）（固定鹽酸加入量為40 μL）和加入量（20、30、40、50、60 μL）（固定鹽酸濃度為0.3 mol/L）對LTB4提取回收率的影響。結果表明，LTB4的提取回收率隨鹽酸濃度的增加而增加，當鹽酸濃度為0.3 mol/L時LTB4提取回收率最大，繼續加大鹽酸濃度LTB4提取回收率反而下降；LTB4的提取回收率隨著鹽酸加入量的增加而增加，加入50 μL 鹽酸 時LTB4提取回收率最大，繼續加大鹽酸用量時LTB4提取回收率下降。故確定加入鹽酸濃度為0.3 mol/L，加入量為50 μL。樣品酸堿度對LTB4提取回收率的影響結果見圖1B、C。

2.6.3 平衡溫度 在CPE過程中，固定Triton X-114濃度為5%，鹽酸的濃度為0.3 mol/L、加入量為50 μL，平衡時間為30 min，分別考察平衡溫度（40、45、50、55、60 ℃）對LTB4提取回收率的影響。結果表明，LTB4提取回收率隨溫度的升高而增加，平衡溫度為50 ℃時，LTB4提取回收率最大，繼續升高溫度LTB4提取回收率不再增加，故確定平衡溫度為50 ℃。平衡溫度對LTB4提取回收率的影響結果見圖1D。

2.6.4 平衡時間 在CPE過程中，固定Triton X-114濃度為5%，鹽酸濃度為0.3 mol/L、加入量為50 μL，平衡溫度為50 ℃，分別考察平衡時間（10、15、20、25、30 min）對LTB4提取回收率的影響。結果表明，平衡20 min可使樣品中LTB4的提取回收率達到最大值，延長平衡時間LTB4提取回收率不再增加，故確定平衡時間為20 min。平衡時間對LTB4提取回收率的影響結果見圖1E。

2.7 分析方法驗證

2.7.1 專屬性 精密量取100 μL空白血漿的替代基質，不加內標；200 μg/L的LTB4對照品溶液10 μL，氮氣下吹干，加入100 μL空白血漿的替代基質；豚鼠給藥后收集的血漿樣品。根據“2.6”優化條件，將以上樣品分別按“2.5”項方法處理后進樣測定。結果，LTB4、內標吲哚美辛與內源性物質分離良好，保留時間分別為2.52、2.78 min，各相鄰峰間分離度均大于1.5，血漿中內源性物質不干擾LTB4和內標的測定，色譜圖見圖2。

2.7.2 標準曲線及線性范圍 分別精密量取LTB4系列對照品溶液10 μL于1.5 mL空白離心管中，加入空白血漿的替代基質，制備成LTB4血漿濃度分別為1、5、10、20、50、100 μg/L的樣品，根據“2.6”優化的條件按“2.5”項下方法進行樣品處理，然后按“2.1”項下條件進樣分析。以LTB4與內標吲哚美辛峰面積的比為縱坐標（y）、樣品濃度為橫坐標（x）進行線性回歸，擬合標準曲線方程為y=0.054x-0.008（r=0.999 0）。結果表明，LTB4血藥濃度在1～100 μg/L范圍內與峰面積的線性關系良好。

2.7.3 準確度和精密度 分別配制LTB4血漿質量濃度為2、25、80 μg/L的QC樣品，每個濃度進行6樣品分析，根據“2.6”優化的條件按“2.5”項下方法進行樣品處理，然后按“2.1”項下條件進樣分析，共進行3批次分析，計算批內、批間精密度[以變異系數（CV）表示]和準確度。結果表明，2、25、80 μg/L QC樣品的批內和批間精密度以及準確度結果均符合生物樣品分析要求。準確度和精密度試驗結果見表1。

2.7.4 提取回收率和基質效應 分別精密量取LTB4質控用對照品溶液10 μL于1.5 mL空白離心管中，加入空白血漿的替代基質，制備LTB4質量濃度為2、25、80 μg/L的血漿替代基質樣品，按“2.5”項下方法進行樣品處理；分別精密量取LTB4質控用對照品溶液10 μL于1.5 mL空白離心管中，氮氣下吹干，加入乙腈100 μL，混勻即得對照品溶液；另分別精密量取空白血漿的替代基質100 μL，不加內標，按“2.5”項下方法進行樣品處理，在處理后上清液中分別加入10 μL質控用對照品溶液和10 μL內標溶液，混勻即得基質樣品。每個質量濃度進行3樣品分析，計算LTB4的提取回收率和內標歸一化的基質效應。結果表明，2、25、80 μg/L 3個質量濃度下LTB4的提取回收率和基質效應均符合生物樣品分析要求。提取回收率和基質效應測定結果見表2。

2.7.5 穩定性 分別制備LTB4質量濃度為2、80 μg/L的QC樣品，考察QC樣品在室溫放置4 h、自動進樣器中（4 ℃）中放置24 h、經歷3次冷凍-解凍循環和-70 ℃放置90 d的穩定性，每個濃度進行3樣品分析。結果表明，QC樣品在上述條件下均穩定，不同條件下穩定性試驗結果見表3。

2.8 豚鼠血漿中LTB4的濃度測定

采用UPLC-MS/MS法測得空白組、模型組和射干提取物組豚鼠血漿中LTB4的質量濃度分別為（1 078.23±12.54）、（1 136.25±11.59）、（1 085.36±10.91）ng/L。采用SPSS 24.0統計學軟件對結果進行單因素方差分析。結果表明，與空白組比較，模型組豚鼠血漿中LTB4濃度顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，射干提取物組豚鼠血漿中LTB4濃度顯著降低（P<0.05），且與空白組差異無統計學意義（P>0.05）。表明造模后氣道炎癥豚鼠血漿中LTB4濃度升高，給予射干提取物后血漿中LTB4濃度上升。

3 討論

濁點是非離子表面活性劑的特性，即隨溫度的升高表面活性劑均相膠束溶液出現渾濁現象時的溫度。CPF過程中常用的非離子表面活性劑有Triton X-114、Triton X-100、聚山梨酯20和聚山梨酯80，其濁點分別為23、64、95和85 ℃。由于CPF平衡溫度需高于濁點15～20 ℃[15]，而Triton X-114的濁點溫度顯著低于其他表面活性劑，兼顧生物樣品高溫下的不穩定性，故本研究最終選擇Triton X-114為表明活性劑對生物樣品進行萃取。LTB4為弱酸性物質，采用鹽酸調節樣品的pH值至弱酸性，既保證了LTB4以分子狀態被包封于表面活性劑膠束的疏水核內部，又有助于提高LTB4的提取回收率。但是當鹽酸加入量過大時，由于離子抑制效應，LTB4提取回收率反而下降。采用CPF進行生物樣品前處理，相比于傳統的蛋白沉淀法、液液萃取法、固液萃取法、液相微萃取、固相微萃取等方法，節約了有機試劑的用量、提高了萃取富集效率、降低了分析成本，充分體現了“綠色環保”的理念。

花生四烯酸是一種ω-6多不飽和脂肪酸，分別在環氧合酶、脂氧酶及細胞色素單氧化酶作用下代謝為一系列的代謝產物，為重要的炎癥介導因子[16]。LTB4是花生四烯酸脂氧酶途徑的代謝產物，炎癥反應時體內濃度顯著上調，建立靈敏度高、專屬性強的UPLC-MS/MS方法監測血漿中LTB4濃度，可為炎癥診治提供數據依據。LTB4作為體內內源性生物標記物，無法得到空白生物樣品。因此，本研究制備了44.5 g/L的牛血清白蛋白生理鹽水溶液作為血漿替代基質進行UPLC-MS/MS方法驗證。建立的含量測定方法靈敏度高、準確性好，LTB4提取回收率和基質效應均符合生物樣品分析要求，可用于LTB4的準確定量分析。本研究結果顯示，氣道炎癥模型豚鼠血漿中LTB4濃度顯著升高，而給予射干提取物后血漿中LTB4濃度顯著回調，且接近正常水平。這提示，射干提取物抗炎、止咳的作用機制可能與降低血漿中異常升高的LTB4濃度有關。

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（收稿日期：2018-01-05 修回日期：2018-04-20）

（編輯：林 靜）