細(xì)胞色素C氧化酶亞基Cox4的克隆及高效表達(dá)

蘇明慧， 汪一榮， 楊艷梅， 商巾杰

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210046)

線粒體有自己的基因組，是一種半自主性的細(xì)胞器[1-2]，幾乎存在于所有真核生物中。線粒體能夠進(jìn)行氧化磷酸化和三磷酸腺苷(ATP)的合成，是有氧呼吸的主要場所[3-4]，可為細(xì)胞的生命活動提供能量，被稱為細(xì)胞內(nèi)的發(fā)動機(jī)[5]。同時，線粒體還參與調(diào)控細(xì)胞的信息傳遞、細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞的分化等一系列生理過程，并且還對細(xì)胞生長和細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控[6]，因此，線粒體對細(xì)胞的生長至關(guān)重要[5]。氧化磷酸化是一個電子傳遞過程，依賴于線粒體的電子傳遞鏈。線粒體的電子傳遞鏈對于線粒體功能的正常發(fā)揮十分重要[7]，一旦電子傳遞鏈?zhǔn)軗p會引起很多疾病的發(fā)生[8-9]。在粟酒裂殖酵母中，電子傳遞鏈由4種復(fù)合體組成，而組成這些復(fù)合體的蛋白是由核基因組和線粒體基因組共同編碼的。細(xì)胞色素C氧化酶(復(fù)合物Ⅳ)是線粒體中電子傳遞鏈的末端酶，催化電子從細(xì)胞色素C轉(zhuǎn)移到氧[10]，核編碼的細(xì)胞色素C氧化酶亞基4(Cox4)是其中1個關(guān)鍵亞基。由此可見，在對線粒體功能進(jìn)行研究時，不可避免地需要對線粒體中構(gòu)成這些復(fù)合體的蛋白水平進(jìn)行檢測，因此制備這些蛋白的相應(yīng)抗體就顯得尤為重要。本研究主要是將粟酒裂殖酵母中構(gòu)成復(fù)合體Ⅳ的細(xì)胞色素C氧化酶亞基Cox4在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)，并制備相應(yīng)的抗體。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 粟酒裂殖酵母單倍體菌株yHL6381[h+，組氨酸生物合成缺陷型(his3-D1)，亮氨酸生物合成缺陷型(leu1-32)，尿嘧啶生物合成缺陷型(ura4-D18)，腺嘌呤生物合成缺陷型(ade6-M210)]，由南京師范大學(xué)微生物所實(shí)驗室保存。質(zhì)粒pET-28a(+)為筆者所在實(shí)驗室保存。

1.1.2 試劑 rTaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、SolutionⅠ(貨號為6022)、蛋白marker，購自TaKaRa公司；DNA marker，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA割膠回收試劑盒、PCR過柱純化試劑盒，購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS)、瓊脂粉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、山梨醇(sorbitol)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、30%丙烯酰胺和乙二胺四乙酸(EDTA)，購自索萊寶公司；酵母粉，購自O(shè)XOID公司；腺嘌呤、尿嘧啶、精氨酸、組氨酸、卡那霉素(Kan)，購自Sigma公司；RNA提取試劑盒，OMEGA(貨號為R6870-00)，購自南京貝納生物技術(shù)有限公司；iScript cDNA合成試劑盒(貨號為1708890)，購自南京潤亞生物科技發(fā)展有限公司；PCR引物，由南京思普金生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；常用試劑為分析純級，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司和生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 (1)LB培養(yǎng)基配方(100 mL)：1 g胰蛋白胨，0.5 g 酵母粉，1 g氯化鈉，在固體培養(yǎng)基中添加2 g瓊脂粉。(2)LB+Kan培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基中添加卡那霉素至終濃度為50 mg/L。(3)YES培養(yǎng)基配方(100 mL)：3.0 g葡萄糖，0.5 g酵母粉，22.50 mg腺嘌呤，22.50 mg尿嘧啶，22.50 mg 亮氨酸，22.50 mg 組氨酸。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物的設(shè)計 根據(jù)裂殖酵母序列信息數(shù)據(jù)庫(S.pombe_GeneDB)中登錄號為SPAC1296.02的基因序列，通過https：//ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html預(yù)測線粒體定位序列，將線粒體定位序列去掉后，設(shè)計上下游特異性引物，在正向引物的5′端加入NdeⅠ酶切位點(diǎn)，在互補(bǔ)鏈引物的5′端加入XhoⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線分別表示NdeⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn))：正向引物：5′-GGAATTCCATATGAATGAGCAAAACGTTGTAAAAGCC-3′；反向引物：5′-CCGCTCGAGATGACTGTGTTCAGCGTTG GG-3′。

1.2.2 PCR片段擴(kuò)增 取用YES培養(yǎng)過夜的粟酒裂殖酵母1.5 mL，離心收集菌體。按照OMEGA的說明書提取總RNA，然后加入反轉(zhuǎn)錄酶，以隨機(jī)六聚體為引物合成cDNA，然后以此cDNA為模板，用SPAC 1296.02的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR片段用PCR過柱純化試劑盒進(jìn)行純化。

1.2.3 原核表達(dá)載體pET-28a(+)/cox4p的構(gòu)建 把純化后的PCR片段與pET-28a(+)載體進(jìn)行NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收純化雙酶切后的產(chǎn)物，將兩者按合適配比加入到酶連反應(yīng)體系內(nèi)，16 ℃連接過夜；將酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，涂布到含有Kan抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取菌落PCR呈陽性的轉(zhuǎn)化子于LB+Kan的液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)10 h，通過堿裂解法提取重組質(zhì)粒，經(jīng)NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切初步鑒定后，由南京思普金生物技術(shù)有限公司完成測序。將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組表達(dá)菌株。

1.2.4 目的蛋白的表達(dá) 將重組表達(dá)菌接種到5 mL含有50 mg/L Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，將重組表達(dá)菌分別轉(zhuǎn)接到2管15 mL含有50 mg/L Kan的LB液體培養(yǎng)基中，使其D600 nm≈0.2，37 ℃、200 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至D600 nm≈0.6，此時向其中1管菌液中加入 1 mmol/L 異丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside，簡稱IPTG)，于37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。次日，于4 ℃、8 000 r/min離心5 min，收集菌體，之后用100 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH值為7.0)將菌體重懸，重復(fù)洗滌3次后，加入適量緩沖液[含0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，簡稱PMSF)和14.3 mmol/Lβ-巰基乙醇]，將其置于冰浴中進(jìn)行超聲波破碎，破碎10 s，冷卻10 s，待菌體完全破碎后，于4 ℃、12 000 r/min離心 20 min，收集細(xì)胞上清，取適量進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱SDS-PAGE)，以分析目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)情況。

1.2.5 目的蛋白的純化 重組表達(dá)菌破碎完全后，于 16 000g、4 ℃離心30 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中。向上清中加入組氨酸標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(Ni-NTA柱)，根據(jù)Ni-NTA柱的吸附度來決定上清蛋白樣品中需要加入的Ni-NTA體積。在4 ℃低溫冰箱中，用垂直混勻器勻速轉(zhuǎn)動離心管2～4 h，確保目的蛋白與Ni-NTA柱充分接觸并結(jié)合，2～4 h后，1 000g、4 ℃離心2 min，小心地將上清轉(zhuǎn)移到另1支新的1.5 mL離心管中(該上清中含有未與Ni-NTA柱結(jié)合的蛋白)，用Wash Buffer洗滌2～5次離心下來的Ni-NTA柱，保留洗液，該步的目的是去除沒有與Ni-NTA柱結(jié)合或者與Ni-NTA柱結(jié)合不牢固的蛋白。再用Elute Buffer對Ni-NTA柱進(jìn)行洗脫，可將與Ni-NTA柱結(jié)合的目的蛋白洗脫下來。洗脫液的體積按照加入的Ni-NTA柱的體積換算，洗滌3次，洗滌得到的溶液主要含有所純化的目的蛋白。將目標(biāo)蛋白洗脫液置于截留量為3 500 u的透析袋中對蛋白進(jìn)行透析，透析液為100 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH值為6.8)，經(jīng)過3次換液后，將得到的蛋白液吸出并加入1.5 mL 離心管中，這些蛋白樣品可進(jìn)行對照試驗。取適量透析后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，以檢測目的蛋白的純化程度。

1.2.6 抗體的制備與檢測 將純化得到的蛋白作為抗原送巴傲得生物科技有限公司制備相應(yīng)的抗體，然后提取粟酒裂殖酵母的線粒體[11-12]，通過Western-Blot方法檢測抗體質(zhì)量。將線粒體提取液上樣于12%聚丙酰胺凝膠中，進(jìn)行 SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)(硝酸纖維素膜，簡稱NC膜)，條件為 300 mA、100 min。用封閉液(0.137 mol/L NaCl，0.02 mol/L Tris，5%脫脂奶粉，質(zhì)量濃度)封閉硝酸纖維素膜2 h。用TBST緩沖液(含0.02 mol/L Tris，0.137 mol/L NaCl，0.1% Tween 20，調(diào)節(jié)pH值至7.4)洗膜3次，按比例加入一抗，室溫孵育4 h，用TBST緩沖液洗膜3次，再按比例加入二抗，室溫避光孵育1 h，用ODYSSEY激光掃描顯示結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段cox4的擴(kuò)增

以提取的yHL6381菌株的RNA通過反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增目的片段cox4。目的基因cox4的堿基數(shù)為393 bp。如圖1所示，根據(jù)marker，所獲得的目的片段介于250～500 bp之間，且只有1條單一條帶，因此確定該目的片段為cox4。

2.2 重組質(zhì)粒cox4-pET28a的構(gòu)建及驗證

將擴(kuò)增得到的cox4目的片段進(jìn)行PCR過柱純化，將純化后的目的片段與載體質(zhì)粒pET-28a(+)分別用NdeⅠ、XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切過夜后割膠回收載體質(zhì)粒片段，過柱純化目的PCR片段。將純化后的載體片段與目的PCR片段酶連，16 ℃ 反應(yīng)過夜。接下來通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法將酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)入TOP10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于添加卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h后，將平板取出，接種單菌落于添加卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基上，于37 ℃振蕩培養(yǎng) 12 h 后提取重組質(zhì)粒。提取的重組質(zhì)粒如圖2所示。筆者選取圖2中的4號質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證。由圖3的驗證結(jié)果可以看出cox4基因的釋放片段，將4號重組質(zhì)粒送至南京思普金生物科技有限公司測序。由圖4的測序結(jié)果可以看出，該片段與S.pombe_Gene DB數(shù)據(jù)庫中的序列完全一致，表明4號重組質(zhì)粒的構(gòu)建是成功的。

2.3 目的蛋白Cox4的表達(dá)

將上述驗證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，得到帶有pET-28a(+)/cox4的重組菌株，通過IPTG誘導(dǎo)，使得重組質(zhì)粒在細(xì)胞中表達(dá)，得到本研究所需的Cox4蛋白。筆者將經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)和未經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)的重組表達(dá)菌株通過超聲破碎處理后，進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖5所示，在經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)的重組表達(dá)菌的上清組分中，可以看到1條大小為16 ku左右的蛋白條帶，與S.pombe_GeneDB上公布的Cox4蛋白大小18.16 ku相近，表明Cox4蛋白得到了表達(dá)。

2.4 目的蛋白Cox4的純化

在Cox4蛋白成功得到了表達(dá)后，筆者對表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化，通過Ni-NTA柱與目的蛋白結(jié)合，用wash buffer洗去雜蛋白與未與Ni-NTA柱結(jié)合的蛋白，最后用elute buffer將目的蛋白洗脫下來，去除鹽離子后進(jìn)行SDS-PAGE，檢測蛋白的純化效果。從圖6可以看出，經(jīng)過wash buffer洗脫后，去除了大部分雜蛋白，得到了純度較高的目的蛋白。

2.5 Cox4蛋白抗體的制備及檢測

筆者將純化后的Cox4蛋白樣品送至巴傲得生物科技有限公司制備抗體。抗體制備完成后，提取yHL6381的線粒體，通過免疫印記分析試驗對抗體進(jìn)行檢測。如圖7所示，在線粒體提取液中，本試驗成功檢測到了Cox4蛋白且大量富集，其分子量大小與之前表達(dá)的蛋白大小是一致的，表明抗體的制備是成功的。

3 討論

在本研究中，筆者將Cox4蛋白的編碼序列去除線粒體定位序列后克隆到表達(dá)載體pET-28a(+)上，構(gòu)建了pET-28a(+)/cox4重組表達(dá)質(zhì)粒，因為表達(dá)載體pET28a(+)上含有T7/Lac啟動子，該啟動子在受IPTG誘導(dǎo)時會啟動基因的表達(dá)，因此表明重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)，在表達(dá)型的大腸桿菌中成功表達(dá)，通過一系列優(yōu)化后提高了Cox4蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)量，得到了成功表達(dá)的Cox4蛋白。接下來將成功表達(dá)的蛋白以過Ni-NTA柱的方式進(jìn)行純化，使目的蛋白與Ni-NTA柱相結(jié)合，從而去除其他雜蛋白，達(dá)到純化蛋白的目的。最后將純化的蛋白作為抗原送相關(guān)公司制備相應(yīng)的抗體。通過檢測發(fā)現(xiàn)，本研究所制備的抗體是成功的，而且特異性較好，從而為檢測Cox4的蛋白水平研究奠定了基礎(chǔ)。