甲基硫菌靈對(duì)季節(jié)性栽培雙孢蘑菇褐腐病的生物活性及田間防效和安全性評(píng)價(jià)

張 怡， 錢忠海， 劉 琴， 王林貴， 沈迎春

(1.江蘇省農(nóng)藥檢定所，江蘇南京 210036； 2.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇揚(yáng)州 225007；3.江蘇省南京市高淳區(qū)農(nóng)業(yè)委員會(huì)，江蘇南京 211300)

我國(guó)食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，為我國(guó)農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收、循環(huán)農(nóng)業(yè)的發(fā)展發(fā)揮了重要作用。然而隨著食用菌周年生產(chǎn)和栽培規(guī)模的日益擴(kuò)大，食用菌病害的發(fā)生與危害呈現(xiàn)逐年加重的趨勢(shì)，成為制約食用菌產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要因素。一方面病蟲害對(duì)產(chǎn)量造成嚴(yán)重的影響，一般損失量達(dá)食用菌產(chǎn)量的20%～30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50%，甚至絕收[1]；另一方面病害使食用菌產(chǎn)品品質(zhì)降低，經(jīng)濟(jì)效益大幅下降，嚴(yán)重挫傷了菇農(nóng)的生產(chǎn)積極性。

雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)是食用菌的一個(gè)重要品種，是目前世界上栽培最廣泛、栽培量最大的食用菌品種，雙孢蘑菇在分類上屬于真菌門，擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，蘑菇屬。雙孢蘑菇褐腐病又稱蘑菇濕泡病，是由有害疣孢霉菌(Mycogoneperniciosa)引起的一種嚴(yán)重病害[2]。疣孢霉菌的分生孢子和厚垣孢子只感染蘑菇子實(shí)體，不感染菌絲體。在不同發(fā)育階段侵染雙孢蘑菇，其癥狀不同。在雙孢蘑菇子實(shí)體分化前侵染，可形成白色棉狀菌團(tuán)，分不清菇蓋與菇柄，切開其剖面可見菌柄中空，柄基部膨大。在雙孢蘑菇菇蓋與菇柄分化后被侵染，在菇床上菇蕾較短矮，初期其顏色略暗淡、無(wú)光澤，菇蓋表面凹凸不平，之后病菇長(zhǎng)出一層白色絨毛狀菌絲體及分生孢子，發(fā)病后期病菇上出現(xiàn)透明的暗褐色液滴，并伴有腐敗的臭味，最后病菇壞死且呈濕腐狀[2]。其菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)適宜的溫度為25 ℃，高濕有利于菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)[3]，因此，在我國(guó)福建、四川、江蘇、浙江等地區(qū)常有發(fā)生。發(fā)生病害的菇房產(chǎn)量減少10%～25%，病害發(fā)生特別嚴(yán)重的菇房減產(chǎn)達(dá)50%～60%。長(zhǎng)期以來(lái)褐腐病防治主要依賴通風(fēng)消毒等物理防治，而此類方法通常見效較慢、無(wú)法滿足病害嚴(yán)重發(fā)生時(shí)的防治需求。目前，雙孢蘑菇褐腐病的化學(xué)防治研究較少，使用殺菌劑常常由于病原菌和雙孢蘑菇具有相似性，在農(nóng)藥選擇上存在一定困難，因此藥劑儲(chǔ)備不足[4]。生產(chǎn)上常用多菌靈與百菌清進(jìn)行防治，但易產(chǎn)生抗藥性與殘留風(fēng)險(xiǎn)[5]。本試驗(yàn)擬考察甲基硫菌靈對(duì)季節(jié)性栽培雙孢蘑菇的安全性及對(duì)褐腐病室內(nèi)毒力和田間防效的表現(xiàn)，篩選出合理的用藥品種和實(shí)際應(yīng)用技術(shù)，以期解決食用菌生產(chǎn)上的用藥問(wèn)題，保障其生產(chǎn)和產(chǎn)品質(zhì)量安全。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料 雙孢蘑菇、有害疣孢霉菌，均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病理研究室保存。

馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 000 mL。培養(yǎng)基置于黑暗培養(yǎng)箱，溫度設(shè)定為28 ℃。

1.1.2 供試藥劑 97.0%甲基硫菌靈原藥，購(gòu)自江蘇嘉隆化工有限公司；70%甲基硫菌靈可濕性粉劑，購(gòu)自江蘇龍燈化工有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 儀器設(shè)備主要有量筒、三角瓶、培養(yǎng)皿、移液槍、高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、直尺、JN-16C型背包式噴霧器等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 室內(nèi)毒力測(cè)定 在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別配制含 0.05、0.10、0.50、1.00、10.00 mg/L甲基硫菌靈的PDA培養(yǎng)基帶藥平板，并設(shè)不加藥平板作對(duì)照。采用NY/T 1156.2—2006規(guī)定的平皿菌絲生長(zhǎng)抑制法[6]，將雙孢蘑菇、疣孢霉菌接在PDA培養(yǎng)基平板上，于25 ℃預(yù)培養(yǎng)7 d，然后用直徑為 5 mm 的打孔器在靠近菌落邊緣的同一圓周上打取菌餅(保證同一重復(fù)供試病菌的菌齡相同)，并用接種針在無(wú)菌條件下將菌餅接種到帶藥平板中央，菌絲面朝下，并設(shè)不加藥平板作對(duì)照，置于黑暗條件下培養(yǎng)。每個(gè)處理4次重復(fù)。培養(yǎng)7 d后測(cè)量菌落直徑，求出4次重復(fù)的平均值，得出各處理的菌落增長(zhǎng)直徑(菌落增長(zhǎng)直徑=菌落直徑-5 mm)。

1.2.2 田間藥效試驗(yàn) 田間試驗(yàn)于2016年在江蘇省南京市高淳區(qū)東壩鎮(zhèn)游子山食用菌基地進(jìn)行，試驗(yàn)對(duì)象為雙孢蘑菇，品種為AS2796。所有生長(zhǎng)條件同常規(guī)季節(jié)性雙孢蘑菇生產(chǎn)，試驗(yàn)的基本要求和方法參考《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則(一)》[7]中相應(yīng)試驗(yàn)內(nèi)容。菇棚為南北走向，每棚都有2排鋼筋混凝土床架，在棚內(nèi)分列東西兩邊，每排床架為3層，每層有5個(gè)相等的小區(qū)，小區(qū)面積為1.4 m×4.0 m。選擇基地發(fā)病早且嚴(yán)重的菇棚作為試驗(yàn)菇棚，于春菇生長(zhǎng)的盛期施藥，在施藥當(dāng)天不進(jìn)行噴水作業(yè)，其余田間管理參照正常管理。選用生產(chǎn)中常用的器械，記錄所有器械的類型和操作條件(如工作壓力、噴孔口徑等)。施藥應(yīng)保證藥量準(zhǔn)確，分布均勻。用藥量偏差超過(guò)±10%的要進(jìn)行記錄。第1次施藥時(shí)間為2016年3月23日，3月30日調(diào)查藥效后，噴施第2次藥，施藥時(shí)菇棚內(nèi)處于春菇出菇盛期。試驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照與3個(gè)試驗(yàn)劑量，即0.4、0.8、1.6 g a.i./m270%甲基硫菌靈可濕性粉劑。分別于第2次噴藥7、13、17、25、32、38、45 d后調(diào)查各小區(qū)全部培養(yǎng)料上罹病的菇粒數(shù)或菌團(tuán)數(shù)(對(duì)于菇粒或菌團(tuán)≥1 cm者計(jì)數(shù))。重點(diǎn)觀察藥劑對(duì)作物生長(zhǎng)的影響，觀察藥劑有無(wú)推遲子實(shí)體原基發(fā)生、對(duì)子實(shí)體有無(wú)藥害，若有藥害，要記錄藥害的類型和程度，此外，也應(yīng)記錄對(duì)蘑菇的有益影響(如促進(jìn)生長(zhǎng)等現(xiàn)象)。如果藥害能被測(cè)量或計(jì)算，要用絕對(duì)數(shù)值表示，其他情況下，可以按下列2種方法估計(jì)藥害程度和概率：按照藥害分級(jí)方法記錄每個(gè)小區(qū)的藥害情況，以-、+、++、+++、++++表示(表1)；將藥劑處理區(qū)與空白對(duì)照區(qū)進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)其藥害的百分率。同時(shí)，要準(zhǔn)確描述雙孢蘑菇的藥害癥狀，并提供實(shí)物照片、錄像等。對(duì)其他病蟲害的任何影響都應(yīng)記錄，包括有益和無(wú)益的影響。

1.3 計(jì)算方法

計(jì)算藥劑對(duì)病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率，然后將抑制率轉(zhuǎn)化成概率值(y)，濃度轉(zhuǎn)化成對(duì)數(shù)值(x)，求出各藥劑對(duì)雙孢蘑菇的毒力回歸曲線方程(y=a+bx)，以及有效抑制中濃度(EC50)、相關(guān)系數(shù)等。

表1 藥害分級(jí)方法

防治藥效=[對(duì)照區(qū)病菇(菌團(tuán))數(shù)量-處理區(qū)病菇(菌團(tuán))數(shù)量]/[對(duì)照區(qū)病菇(菌團(tuán))數(shù)量]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果

由表2、表3可知，97.0%甲基硫菌靈對(duì)雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)的抑制率在5.99%～33.02%之間，對(duì)疣孢霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率在1.18%～34.90%之間。在離體條件下，97.0%甲基硫菌靈原藥對(duì)雙孢蘑菇和疣孢霉菌均有一定的抑制作用，其有效抑制中濃度分別為67.893 1、50.275 7 mg/L。其對(duì)雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)的抑制濃度高于疣孢霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制濃度，說(shuō)明甲基硫菌靈對(duì)雙孢蘑菇較安全，可用于雙孢蘑菇褐腐病的防治。供試殺菌劑對(duì)雙孢蘑菇疣孢霉菌的毒力測(cè)定結(jié)果表明，甲基硫菌靈對(duì)疣孢霉菌的毒力一般。

表2 甲基硫菌靈對(duì)雙孢蘑菇、疣孢霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制情況

表3 97.0%甲基硫菌靈對(duì)雙孢蘑菇、疣孢霉菌菌絲生長(zhǎng)的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果

2.2 田間藥效試驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知，試驗(yàn)期間，氣溫在8～25 ℃之間，相對(duì)濕度在28%～100%之間，條件較適于雙孢蘑菇褐腐病病菌菌絲生長(zhǎng)。清水對(duì)照處理雙孢蘑菇褐腐病發(fā)生中等，雙孢蘑菇子實(shí)體可見白色棉狀菌團(tuán)，分不清菇蓋與菇柄，柄基部膨大。試驗(yàn)后期，由于溫度升高，同時(shí)菇棚內(nèi)維持較高的濕度(60%～80%)，雙孢蘑菇褐腐病發(fā)生嚴(yán)重，少數(shù)病菇菇蓋表面凹凸不平，部分病菇長(zhǎng)出一層白色絨毛狀菌絲體及分生孢子，極少數(shù)病菇上出現(xiàn)透明的暗褐色液滴，并伴有腐敗的臭味。

由表4可知，第2次噴藥后，70%甲基硫菌靈可濕性粉劑對(duì)雙孢蘑菇褐腐病的防效在47.2%～100.0%之間，防治效果均隨用藥量增加而遞增。其速效性較好，噴藥7 d后，高劑量70%甲基硫菌靈可濕性粉劑對(duì)雙孢蘑菇褐腐病的防效可達(dá)100.0%；持效性一般，噴藥25 d后的防效與噴藥7 d后的防效相比有所下降，防效在47.2%～83.3%之間。田間觀察結(jié)果表明，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，70%甲基硫菌靈可濕性粉劑噴藥 2 d 后就出現(xiàn)輕微藥害，主要藥害癥狀是菇體表面發(fā)黃，6 d后70%甲基硫菌靈可濕性粉劑處理中雙孢蘑菇能恢復(fù)正常生長(zhǎng)，新出菇也能正常生長(zhǎng)。

表4 70%甲基硫菌靈可濕性粉劑對(duì)雙孢蘑菇褐腐病的防治效果

注：防效數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值；同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

由于雙孢蘑菇褐腐病病原菌與雙孢蘑菇具有一定的生物同源性，因此在篩選防治蘑菇褐腐病的殺菌劑時(shí)，必須考慮防效及對(duì)蘑菇生長(zhǎng)的影響。本研究結(jié)果表明，甲基硫菌靈對(duì)疣孢霉菌表現(xiàn)出較為理想的室內(nèi)活性，在離體條件下，97.0%甲基硫菌靈原藥對(duì)雙孢蘑菇和疣孢霉菌具有一定的抑制作用，其有效抑制中濃度分別為67.893 1、50.275 7 mg/L，其對(duì)雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)的抑制濃度高于疣孢霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制濃度，對(duì)雙孢蘑菇使用較為安全。同時(shí)從田間應(yīng)用表現(xiàn)上看，試驗(yàn)范圍內(nèi)，雖然70%甲基硫菌靈可濕性粉劑噴藥2 d后就出現(xiàn)輕微藥害，但6 d后70%甲基硫菌靈可濕性粉劑處理中雙孢蘑菇能恢復(fù)正常生長(zhǎng)，新出菇也能正常生長(zhǎng)。因此，總體可認(rèn)定在雙孢蘑菇可以安全應(yīng)用。就田間防效而言，70%甲基硫菌靈可濕性粉劑速效性較好，第2次噴藥7 d后的防效可達(dá)100.0%，持效期較短，噴藥25 d后不同劑量處理的防效均有所下降，低劑量處理防效不及50%，高劑量處理防效相對(duì)較好，防效高于80%。就化學(xué)防治而言，甲基硫菌靈是防治雙孢蘑菇褐腐病的較好藥劑，建議生產(chǎn)上于病害初期施用2次0.8～1.6 g a.i./m270%甲基硫菌靈，間隔7 d。

值得注意的是，雙孢蘑菇褐腐病的防治是一個(gè)非常棘手的問(wèn)題[8-10]，食用菌生長(zhǎng)發(fā)育的環(huán)境條件很適合雜菌發(fā)生，再加上其人工栽培多在室內(nèi)，通風(fēng)差、陽(yáng)光少、濕度大，而食用菌培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，又為雜菌生長(zhǎng)和繁殖提供了優(yōu)良的物質(zhì)基礎(chǔ)[11-12]。不能單靠1種藥劑或1種方法，必須將各種措施合理地結(jié)合起來(lái)，進(jìn)行綜合防治。研究表明，在夏季對(duì)覆蓋土壤進(jìn)行日光曝曬4～5 d，在覆土7 d前，用3 kg 36%～38%化學(xué)純甲醛，兌水2～3 kg，噴灑于種植蘑菇的覆蓋土中熏蒸 48 h 以上，防病效果較理想，發(fā)病后及時(shí)挖除病菇，能防止病菌再侵染，減輕褐腐病的危害[7]。只用化學(xué)藥劑防除是不能夠滿足食用菌安全生產(chǎn)需要的，必須結(jié)合其他措施，如選育抗病品種、搞好環(huán)境衛(wèi)生、土壤消毒等，才能取得成功。