HPLC-ESI-MS/MS分析金釵石斛花花色苷組成及其抗氧化活性測定

宋小蒙， 王洪新，， 馬朝陽， 寇興然， 賈啟海

(1.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122； 2.國家功能食品工程技術研究中心，江蘇無錫 214122；3.赤水國禮金釵石斛發展有限公司，貴州遵義 564700)

金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)系蘭科石斛屬多年生草本植物，別稱扁金釵、扁黃草、扁草，是名貴的中藥材[1]，具有較高的食用和營養價值，其莖入藥，性微寒，味甘，具有益胃生津、滋陰清熱等功效[2]，主要生長在貴州、四川、廣西、云南等地[3]。金釵石斛花花形俏麗，顏色鮮艷，有較高的藥用價值，能夠滋陰潤肺、增強免疫力、抗衰老[4]等。花色苷(Anthocyanin)屬于類黃酮類物質，是一種天然水溶性色素，廣泛存在于植物的花、果、莖、葉中，具有清除自由基、抗炎癥、降血脂等功效，受到國內外學者的廣泛關注。目前發現的花色苷有20多種，以天竺葵素、矢車菊素、芍藥素、飛燕草素、錦葵素和牽牛花素最為常見[5]。

當前對花色苷類化合物的研究主要集中在紫薯、藍莓、甘藍等物質，對于金釵石斛花花色苷組成的報道很少。本試驗以貴州金釵石斛花為原料，對其進行提取純化并使用高效液相色譜-質譜聯用法(HPLC-MS/MS)分析其組成，進一步通過還原力測定、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法和2，2′-聯氨-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)法對其抗氧化能力進行研究，從不同方面為貴州金釵石斛花的進一步開發和研究提供科學的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金釵石斛花，購自貴州省赤水國禮金釵石斛發展有限公司；AB-8型大孔樹脂，購自滄州寶恩吸附材料科技有限公司；乙醇、甲酸、鹽酸、氯化鐵、六氰合鐵酸鉀、三氯乙酸(TCA)、維生素C、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和過硫酸鉀均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，購自美國Tedia公司；DPPH、ABTS、水溶性維生素E(Trolox)，均購自美國Sigma公司。

Waters超高效液相色譜-質譜聯用儀，購自美國Waters公司，配有可變波長紫外檢測器——二極陣列管檢測器(PDA)和數據處理軟件Masslynx4.1工作站；DZF-6050型真空干燥箱，購自上海一恒科學儀器有限公司；AR224CN型電子天平，購自奧豪斯儀器(上海)有限公司；SHZ-DIII型循環水真空泵，購自上海羌強實業發展有限公司；Multiskan GO全波長酶標儀購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 花色苷的提取與純化 將10 g金釵石斛花干粉浸于1 L 50%乙醇(0.1% HCl)中，4 ℃下遮光提取24 h，抽濾得提取液，50 ℃真空濃縮。將濃縮液上樣于經過預處理[6]的 AB-8型大孔樹脂，用3倍柱體積0.5%甲酸溶液洗脫樹脂，去除糖和蛋白質，然后用3倍柱體積70%乙醇溶液(含1%甲酸)洗脫。洗脫液于50 ℃真空濃縮去除乙醇，真空冷凍干燥得干物質[7]。取一部分溶于水中，其余部分低溫保存。

1.2.2 液相色譜條件 色譜柱：Waters Acquity-BCH C18(柱長100 mm×柱內徑2.1 mm，填料的孔徑為1.7 μm)，流速為0.3 mL/min，柱溫為45 ℃，進樣量為3 μL，檢測器：二極管陣列檢測器，檢測波長為520 nm，梯度洗脫條件見表1。

1.2.3 質譜條件 電噴霧離子源(ESI)：正離子掃描模式，毛細管電壓為3.2 kV，錐孔電壓為30 V，離子源溫度為100 ℃，脫溶劑溫度為400 ℃，脫溶劑氣流量為700 L/h，錐孔氣流量為50 L/h，離子掃描范圍m/z為100～2 000。

表1 梯度洗脫條件

1.2.4 還原力測定 用鐵氰化鉀法測定還原力[8]。取 10 mL 離心管，依次加入2.5 mL不同濃度的樣品、2.5 mL 2.5 mol/L的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(pH值為6.6)和2.5 mL 1%六氰合鐵酸鉀溶液，50 ℃水浴20 min；冷水冷卻后，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸(TCA)溶液，混勻，3 000 r/min下離心10 min，取上清 2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸餾水、0.5 mL 0.1% FeCl3溶液，充分混勻，靜置10 min，以水為空白、維生素C為陽性對照，于700 nm測定吸光度。

1.2.5 金釵石斛花對DPPH·清除試驗 以Trolox為陽性對照，進行DPPH·清除能力測定[9-10]。在96孔板中加入 270 μL 60 μmol/L DPPH和30 μL不同濃度樣品，避光反應 5 min，放入酶標儀中，于517 nm測定吸光度，并計算清除率：

DPPH·清除率=[1-(D1-D2)/D0]×100%。

式中：D1為樣品與DPPH反應后在517 nm處的吸光度；D2、D0分別為空白樣品、DPPH在517 nm處的吸光度。

1.2.6 金釵石斛花對ABTS+·的清除試驗 以Trolox為陽性對照，進行ABTS清除能力測定[11]。將3.5 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L過硫酸鉀以2 ∶1體積比混合，避光，室溫下反應12～16 h，即得ABTS+·儲備液。在96孔板中加入 200 μL ABTS+·儲備液和10 μL不同濃度樣品，反應10 min后放入酶標儀中，于734 nm測定吸光度，并計算清除率：

ABTS+·清除率=[1-(D1-D2)/D0]×100%。

式中：D1為樣品與DBTS+·反應后在734 nm處的吸光度；D2為空白樣品在734 nm處的吸光度；D0為ABTS+·儲備液在734 nm處的吸光度。

2 結果與分析

2.1 金釵石斛花花色苷組分分析

圖1是金釵石斛花花色苷溶液在520 nm下的HPLC圖譜，可以看出，金釵石斛花花色苷含有多種不同的成分，主要有13種。結合保留時間、質譜信息和相關文獻[12-21]對各峰進行推測。圖2為峰1的質譜圖，保留時間為 8.33 min，分子離子m/z為611，碎片離子m/z為287。其中碎片離子(m/z=287)是分子離子(m/z=611)失去1分子槐糖基(相對分子量為324)所得，碎片離子(m/z=287)為矢車菊素花色苷的特征離子，因此推測峰1為矢車菊素-3-槐糖苷。

峰2的保留時間為9.62 min，分子離子m/z為449，碎片離子m/z為287。其中碎片離子(m/z=287)是分子離子失去1分子葡萄糖基(相對分子量為162)所得，碎片離子(m/z=287)為矢車菊素花色苷的特征離子，因此推測峰2為矢車菊素-3-葡萄糖苷。峰3的保留時間為12.85 min，分子離子m/z為919，碎片離子m/z為287、449、757。其中，碎片離子(m/z=757)是分子離子失去1分子葡萄糖基(相對分子量為162)所得，碎片離子(m/z=449)是分子離子失去1分子槐糖苷和1分子香豆酰(相對分子量為324+146)所得，碎片離子(m/z=287)是碎片離子(m/z=449)失去1分子葡萄糖苷(相對分子量為162)所得，m/z=287的碎片離子為矢車菊素花色苷的特征離子，因此推測峰3為矢車菊素-3-對羥基香豆酰槐糖苷-5-葡糖苷。峰4的保留時間為14.44 min，分子離子m/z為535，碎片離子m/z為287。其中，碎片離子(m/z=287)是分子離子失去1分子葡萄糖基和1分子丙二酰基(相對分子量為162+86)所得，碎片離子(m/z=287)為矢車菊素花色苷的特征離子，因此推測峰4為矢車菊素-3-O-丙二酰葡萄糖苷。峰5的保留時間為 16.50 min，分子離子m/z為757，碎片離子m/z為287、449。其中，碎片離子(m/z=449)是分子離子失去1分子蕓香糖苷(相對分子量為308)所得，碎片離子(m/z=287)是m/z=449失去1分子葡糖苷(相對分子量為162)所得，碎片離子(m/z=287)為矢車菊素花色苷的特征離子，因此推測峰5為矢車菊素-3-蕓香糖苷-5-葡糖苷。

其他各峰的推測方法與峰1～峰5相同，其質譜信息和推測化合物見表2，本研究僅給出峰1的MS、MS/MS圖。觀察發現經過酰基化的花色苷保留時間基本大于未酰基化花色苷，多酰化花色苷保留時間大于單酰化花色苷，相同種類花色苷糖基不同，保留時間也不一樣。

表2 金釵石斛花中主要花色苷組分

2.2 金釵石斛花花色苷抗氧化能力測定

2.2.1 還原能力的測定 Fe3+得到電子后被還原為Fe2+，體系顏色發生改變，因此可通過顏色變化觀察氧化還原狀態的改變，吸光度越大說明還原力越強，利用此原理檢測金釵石斛花花色苷的還原能力。從圖3可以看出，在試驗濃度范圍內，隨著樣液濃度的升高，還原能力呈上升趨勢，而在同一濃度下維生素C的還原力高于金釵石斛花花色苷的還原能力。

2.2.2 金釵石斛花花色苷對DPPH·的清除作用 DPPH·是一種穩定的有機自由基，醇溶液呈紫色，517 nm處有強吸收，得到1個電子后吸收消失，溶液變淺，其褪色程度與得到電子數相關，因此可利用分光光度法快速測定。從圖4可以看出，石斛花花色苷與Trolox均具有較強的清除能力，且清除率隨濃度增大而提高，當濃度為500 μg/mL時樣液的清除率達86%。兩者的半抑制濃度(IC50)分別為33.17、159.92 μg/mL。

2.2.3 金釵石斛花花色苷對ABTS+·的清除作用 ABTS+·與DPPH·類似，均為穩定的有機自由基，抗氧化能力越強，提供電子的能力越強，反應速率越快，因此可以通過測定吸光度判斷其抗氧化能力大小。從圖5可以看出，樣液和Trolox的清除率均隨濃度增大而增大，兩者的IC50分別為33.55、525 μg/mL，Trolox的清除能力明顯大于樣液。

3 結論

本試驗采用HPLC-MS/MS聯用法測定金釵石斛花花色苷組分，其中矢車菊素類化合物有10種，飛燕草色素類化合物有3種，以矢車菊素類化合物為主。此外發現，酰基化的花色苷保留時間基本大于未酰基化花色苷，多酰化花色苷保留時間大于單酰化花色苷，對于相同種類花色苷，糖基不同，保留時間也不一樣。金釵石斛花花色苷的還原力隨著樣液濃度的升高而升高，且具有較強的DPPH自由基清除能力，清除率隨濃度增大而增大，當濃度為500 μg/mL時清除率達86%。金釵石斛花花色苷對ABTS+·的清除率隨濃度增大而增大，其IC50為 525 μg/mL。