3種作物初期生長對全氟辛烷磺酸鹽和全氟辛酸的響應及富集特征

楊鴻波， 廖朝選， 趙亞洲， 謝 勛， 譚 紅

(1.北京化工大學，北京 100029； 2.貴州省分析測試研究院，貴州貴陽 550002)

全氟化合物具有極高的化學穩定性和良好的疏水疏油性，在民用和工業產品生產中被廣泛應用[1-2]。隨著經濟的快速發展，大量的全氟化合物被暴露于環境中，通過呼吸和攝食被生物體吸收，在生物體內蓄積，由于其持久性強，已成為當前環境中最難降解的污染物之一[3-4]。全氟辛烷磺酸鹽(perfluorooctane sulphonate，簡稱PFOS)和全氟辛酸(perfluorooctanoic acid，簡稱PFOA)是被普遍檢出的全氟化合物[5-6]，具有高生物蓄積性，同時對生物體具有生殖毒性、免疫毒性、神經內分泌毒性、肝臟毒性、發育神經毒性等[7-8]，且由其引起的神經毒性具有潛伏性，往往在個體成熟后才顯現出來[9]；其中PFOA還可影響胚胎發育、生物行為，并可造成DNA損傷[10]。PFOS和PFOA的大量生產與廣泛利用，使得在動、植物體內被廣泛檢出，其對環境產生了嚴重危害[11]；PFOS或PFOA通過人類攝食蔬菜、禽蛋、肉類等食物而間接進入人體，正威脅著人類的健康。了解PFOS和PFOA對植物的生長影響以及在體內的分布，可為植物中全氟化合物的污染阻控提供數據支持。

針對PFOS和PFOA對植物生長發育的影響，Stahl等在2009年率先系統研究春小麥、燕麥、馬鈴薯、玉米、多年生黑麥草等5種植物對土壤中PFOA和PFOS的生物利用性，結果發現，0.25～50.00 mg/kg范圍內高濃度的PFOA和PFOS對植物的生長會產生影響，特別是對馬鈴薯而言，土壤中的PFOA和PFOS濃度就越高，植物中全氟化合物(perfluorinated compounds，簡稱PFCs)濃度就越高，且營養器官比儲能器官更敏感[12]。呂振娥等通過研究小麥、大麥、白菜、白車軸草、綠豆等5種植物在短期內受PFOS的抑制作用發現，小麥根伸長的半效應濃度(median effect concentration，簡稱EC50)為352 mg/kg，最為敏感[13]。Qu等發現，低濃度的PFOS可以輕微刺激小麥幼苗的生長，誘導小麥幼苗中葉綠素和可溶性蛋白質的合成，而當PFOS濃度超過10 mg/L時可抑制根生長，影響根、葉生物量，并阻礙葉綠素的累積和可溶性蛋白質的合成[14]。由此可知，PFOA和PFOS可以被植物從土壤中吸收并對植物產生影響，但影響程度不同。

植物可以從土壤中吸收富集PFOS和PFOA，并由根部向莖葉部分遷移，且主要富集在植物的營養器官中[15]。通過研究小麥對PFCs的吸收動力學特性發現，小麥根部對PFOA的吸收速度遠大于PFOS，在暴露100 h時，趨近于穩定，且根部的吸收大于莖的吸收，溫度、鹽度、pH值、受試物濃度對根部吸收2種全氟化合物均具有一定程度的影響[16-17]，總體來看，PFOS主要被根部吸收。Krippner等通過水培法研究3種全氟羧酸(perfluorocarboxylic acids，簡稱PFCAs)和7種全氟烷基磺酸(perfluoroalkylsulfonic acids，簡稱PFSAs)全氟化合物的碳鏈以及pH值對玉米富集全氟化合物的影響，結果發現，玉米對PFSAs類化合物吸收速率最快的是長鏈PFOS，短鏈PFCAs容易在莖葉中富集，長鏈PFCAs和PFOS主要富集在根部[18]。在真實環境中，Zhang等通過分析遼寧省大連市闊葉和針葉植物中10種PFCAs和4種PFSAs的分布發現，針葉對PFCAs和PFSAs的吸收均大于闊葉，葉片中PFCAs含量大于PFSAs，短鏈PFSAs含量高于長鏈等[19]。

當前，眾多專家學者使用小麥進行了大量的吸收動力學研究，并對比研究了植物對不同碳鏈及不同基團全氟化合物的吸收作用，而對于相同碳鏈不同基團的PFOA、PFOS在單獨和聯合作用的研究較少；不同作物對PFOA、PFOS的吸收利用情況不同，目前針對油類作物大豆、油菜以及糧食作物水稻對全氟化合物富集作用的研究較少。我國土壤中的PFOS、PFOA含量大多在5 ng/g以內，最高值為62.45 ng/g[20-22]。低濃度的PFOS會輕微刺激根的生長和酶活性的提高，而當濃度增至 200 mg/kg 時，會抑制根的生長和酶活性的提高，且會提高滲透性。研究PFOS和PFOA對水稻、大豆、油菜的生長發育影響及在3種作物體內的分布特征，以期為全面評價全氟化合物對人類的潛在危害提供理論數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試種子 禾本科單子葉植物水稻(Oryzasativa)種子由四川省綠丹種業有限責任公司生產(批次：201512)；豆科雙子葉植物大豆(Glycinemax)種子由江西省豐城市航城種業有限公司生產(批次：20160303)；十字花科雙子葉植物油菜(BrassicacampestrisL.)種子由貴州農業科學研究院研制(批次：201609)。

試驗前將作物種子在10%次氯酸鈉消毒液中浸泡 10 min，然后把種子轉移到培養皿中并用去離子水漂洗后浸泡，大豆種子浸泡20 min，油菜種子浸泡30 min，水稻種子浸泡1 h。

1.1.2 試驗土壤 試驗土壤為黃壤土，采集于貴州省植物園天然林內，未使用化肥并遠離化學污染源，風干后過2 mm篩備用。土壤的pH值為5.90，有機質含量為2.92%，陽離子交換量為18.1 cmol/kg。

1.1.3 儀器與設備 人工氣候培養箱(北京科偉永興儀器有限公司制造)，箱內密布LED燈。

試驗用花盆為一次性花盆，直徑為18 cm，有效播種面積約為250 cm2，帶儲水盤。

液相色譜-質譜聯用儀：Agilent LC-MS/MS，1290-6460 Agilent 1290 Infinity二元泵(G4220A)，Agilent 1290 Infinity高效自動進樣器(G4226A)，Agilent 1290 Infinity系列柱溫箱(G1316C)，Agilent6460三重四級桿電噴霧離子源(electron spray ionization，簡稱ESI)，MassHunter (B.08.00)工作站。N-EVAP-24氮吹儀(美國Organomation Associates，Inc.制造)。梅特勒-托利多電子天平，測量精度為0.000 1 g；Milli-Q超純水儀(默克密理博公司制造)。

1.1.4 試劑與固相萃取柱 全氟辛烷磺酸鉀鹽(PFOS-K，CAS：2795-39-3，百靈威科技有限公司，純度>98%)；全氟辛酸(PFOA，CAS：335-67-1，百靈威科技有限公司，純度>98%)；甲醇(液相色譜-質譜聯用級，Merck Drugs & Biotechnology)；丙酮[分析純，重慶川東化工(集團)有限公司]；甲醇、氨水、甲酸、乙酸銨、異丙醇均為分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

CNWBOND WAX弱陰離子交換固相萃取柱(solid-phase extraction，簡稱SPE)(上海安普實驗科技股份有限公司)，500 mg×6 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 濃度設置 分別設置1.0、5.0、25.0 mg/kg PFOS組和PFOA組，2.0、10.0、50.0 mg/kg聯和試驗組(CPFOS∶CPFOA=1 ∶1)。

1.2.2 暴露試驗土壤制備 準確稱取0.287 0 g PFOS、0.287 1 g PFOA，分別置于25 mL容量瓶中，用丙酮溶解并稀釋得到濃度均為11.25 mg/mL的PFOS、PFOA儲備液。(1)PFOS試驗組：分別取0.4、2.0、10.0 mL PFOS儲備液加入到3份質量均為100 g的試驗土壤中，攪拌混勻并揮干溶劑備用。另稱取4.4 kg試驗土壤，將制備的100 g加藥土壤加入其中，趁干攪拌混勻，然后加入800 mL去離子水繼續攪拌混勻，得到1.0、5.0、25.0 mg/kg PFOS暴露試驗土壤，然后將各濃度土壤平均分為3份置于花盆中備用。(2)PFOA試驗組：取樣量與操作方法同PFOS試驗組，且同樣將制備得到的1.0、5.0、25.0 mg/kg的PFOA暴露試驗土壤平均分為3份置于花盆中備用。(3)聯和試驗組(CPFOS∶CPFOA=1 ∶1)：分別依次取PFOS、PFOA儲備液各0.4、2.0、10.0 mL 加入到3份質量均為100 g的試驗土壤中，攪拌混勻并揮干溶劑備用。另稱取4.4 kg試驗土壤，將制備的100 g加藥土壤加入其中，趁干攪拌混勻，然后加入800 mL去離子水繼續攪拌混勻，得到2.0、10.0、50.0 mg/kg混合暴露試驗土壤，然后將各濃度土壤平均分為3份置于花盆中備用。(4)對照組：取100 g試驗土壤，加入20.0 mL丙酮，攪拌混勻并揮干溶劑備用。另稱取4.4 kg試驗土壤，將制備的100 g加丙酮的土壤加入其中，趁干攪拌混勻，然后加入800 mL去離子水繼續攪拌混勻，得到對照組試驗土壤，然后將該土壤平均分為3份置于花盆中備用。

1.2.3 暴露試驗 參照GB/T 31270.19—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則》“第19部分：非靶標植物影響試驗”中300～1 000粒/m2的播種密度要求，結合種子大小與分析測試要求，每盆播種的種子數量為水稻20粒、大豆10粒、油菜25粒，種植密度分別約為800、400、1 000粒/m2。試驗時將預處理后的水稻、大豆、油菜種子分別播種于各濃度系列及對照組的花盆中，然后置于培養箱中準備試驗，并將儲水盤蓄水以保證試驗所需水分供應。培養箱的光—暗周期設置為16 h—8 h；光照時溫度為(25±2) ℃，黑暗時溫度為(22±2) ℃；在種子萌芽前，濕度保持在80%以上，種子萌芽后控制濕度在70%～85%之間。

試驗開始后，記錄種子的出苗情況，并在對照組種子半數萌芽后第14天，取出各盆試驗植物，進行株高、生物量測定。

1.2.4 全氟化合物在植物體內的分布特征分析 將各植物根、莖、葉分離并分別剪碎制得的根、莖、葉樣品。稱取1.0 g樣品，加20 mL甲醇振蕩提取，經渦旋、離心處理使其上部澄清；然后取1 mL上清液，加入5 mL 2%甲酸水溶液，經渦旋處理后制備得試樣初提取液。

取wax-SPE小柱，使用2 mL甲醇和1 mL去離子水分別活化，再使用2%甲酸水溶液平衡。然后將試樣初提取液加入柱中，使用2 mL 2%甲酸水溶液淋洗，再用4 mL 3%氨化甲醇洗脫，經氮氣吹干后，用甲醇和水(體積比為1 ∶1)混合液定容至1 mL，制備得試樣提取液，然后用液相色譜-質譜聯用儀測定。試驗時分別使用莖、葉、根進行基質加標回收率試驗，其回收率在88.9%～98.4%之間，樣品的測定不進行回收率校正。

儀器及條件為色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18，2.1 mm×50 mm，1.8 μm；柱溫為40 ℃；進樣體積為2 μL；進樣針沖洗 ∶端口清洗(異丙醇 ∶水體積比為1 ∶1)，2 s；流動相：A=5 mmol/L 乙酸銨水溶液，B=甲醇，流速為 0.20 mL/min。梯度洗脫程序：0～0.50 min，70.00% A+30.00% B；0.51 min，50.00% A+50.00% B；4.50 min，20.00% A+80.00% B；5.00 min，70.00% A+30.00% B，總運行時間6 min(平衡時間1 min)。質譜(mass spectrometry，簡稱MS)配置和條件：負離子模式；掃描模式：多反應監測(multiple reaction monitoring，簡稱MRM)，毛細管電壓為 -3 500 V，噴嘴電壓為-500 V，霧化器壓力為0.31 MPa，干燥器溫度為300 ℃，干燥器流速為6 L/min，鞘氣溫度為300 ℃，鞘氣流速為10 L/min，電子倍增器電壓為400 V，質譜MRM參數見表1。

表1 質譜儀參數

1.2.5 數據分析 PFOS和PFOA對作物出苗率、株高、生物量的影響采用SPSS 11.5軟件進行統計和分析，以P<0.05作為顯著性差異水平。

采用莖、葉、根對PFOS和PFOA的富集因子(root concentration factor，簡稱RCF)、傳輸因子(transfer factor，簡稱TF)進行作物體內的富集體征分析，并評價其對植物的潛在影響。采用色譜工作站MussHunter對數據進行采集和定量分析，采用Origin Pro 8.0對數據進行統計和繪圖。根富集因子[9]的計算公式為

(1)

式中：C根為作物根中PFOS或PFOA濃度，mg/kg干基；C土壤為有機質歸一化后土壤中PFOS或PFOA濃度，mg/kgoc干基。

傳輸因子可指示供試植物自根向莖、葉傳輸化合物的能力，其計算公式為

(2)

式中：C莖葉為作物莖、葉中PFOS、PFOA濃度，mg/kg干基；C根為作物根中PFOS、PFOA濃度，mg/kg干基。

2 結果與分析

2.1 PFOS、PFOA對3種植物出苗率、株高、生物量的影響

在各濃度的PFOS、PFOA暴露試驗土壤以及PFOS和PFOA混合暴露試驗土壤中，所有種子全部發芽；水稻株高約30 cm，生物量約0.055 g/株；大豆株高約21 cm，生物量約 0.53 g/株；油菜株高約3.4 cm，生物量約0.007 g/株，對照組與各處理組出苗率、株高、生物量差異較小。

2.2 PFOS、PFOA在3種植物植株根內的富集情況

由圖1可知，水稻、大豆、油菜根中PFOS、PFOA濃度與土壤中供試物濃度均呈極顯著的線性相關關系，且隨土壤中供試物濃度的增大而增加。與Stahl等的結論[12]相似，即隨著土壤中PFOS、PFOA濃度的增加，PFOS、PFOA向植物中轉移的量也增加。

由表2、表3可知，PFOS在水稻、大豆、油菜根中的富集濃度分別為9.9～87.0、2.4～42.8、1.9～15.9 mg/kg，經有機質歸一化后其富集因子分別為0.103～0.292、0.051～0.111、0.019～0.058，表明3種作物對PFOS的富集能力表現為水稻>大豆>油菜；水稻、大豆、油菜對PFOS的傳輸因子分別為 0.220～0.262、0.193～0.345、0.316～0.368，均小于1，表明3種植物均可自根向莖葉傳輸PFOS，根中濃度大于莖葉[11]。

PFOA在水稻、大豆、油菜根中的富集濃度分別為11.0～81.1，3.3～53.4，18.6～141.7 mg/kg，經有機質歸一化后其富集因子分別為0.096～0.368、0.063～0.097、0.168～0.549，表明3種作物對PFOA的富集能力表現為油菜>水稻>大豆；水稻、大豆、油菜對PFOA的傳輸因子分別為 0.236～0.675、0.056～0.143、0.099～0.120，均小于1，表明3種植物均可自根向莖葉傳輸PFOA，根中濃度大于莖葉。

表2 3種植物對PFOS和PFOA的富集情況

表3 3種植物對PFOA、PFOS的RCF和TF

由圖2可以看出，在PFOS、PFOA聯和試驗中，3種作物對PFOS、PFOA的富集量隨供試物濃度增大而增加，與單獨試驗一致；由表2可知，水稻、大豆、油菜根中的富集濃度分別為23.8～189.9、6.7～146.2、26.4～151.7 mg/kg，莖葉中的富集濃度分別為5.1～56.5、3.0～91.0、12.3～45.2 mg/kg，PFOS、PFOA聯合試驗與單獨試驗的總富集量無明顯差異。

3 討論

當土壤中PFOS、PFOA濃度為1.0～25.0 mg/kg時，PFOS、PFOA對水稻、大豆、油菜的出苗率、株高、生物量均無明顯影響，這與趙淑艷研究中PFAs對小麥的生物量無明顯影響[15]一致。水稻和小麥、大豆、油菜分別所屬的禾本科、豆科、十字花科農作物在我國種植范圍最廣、生產量最多，表明在當前土壤背景下，PFOS和PFOA不足以影響作物的生產。但在Zhou等的研究中，當PFOS的濃度升高至200 mg/L時，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，簡稱SOD)和過氧化物酶(peroxidase，簡稱POD)活性明顯降低[23]，表明在高濃度PFOS條件下，小麥幼苗抗氧化防御系統可能會受到損害，PFOS和PFOA對作物的影響仍不可忽視。

植物中的PFOS、PFOA濃度與土壤中的PFOS、PFOA濃度呈線性相關關系，且隨土壤中供試物濃度的增大而增加。在3種植物中，不管PFOS、PFOA是單獨存在，還是等比例存在于土壤中時，在植物根部的富集量均高于在莖葉中的富集量。Wen等研究發現，較短鏈全氟磺酸(perfluorosulfonic acids，簡稱PFSAs)主要通過轉移集中在莖葉中，而長鏈PFCAs如全氟辛酸(PFOA)、全氟壬酸(PFNA)、全氟癸酸(PFDA)、全氟辛烷磺酸己烷磺酸(PFHxS)、全氟辛烷磺酸(PFOS)，主要通過吸收集中在根部[24]，由于二者具有相同的碳鏈結構(C>4)，說明在由土壤轉移到根部時，由土壤轉移到根部時，土壤孔隙中的化合物經被動擴散被植物根吸收，再經過木質部的水相或韌皮部汁液的蒸騰作用轉移到植物體內，起主要作用的是親脂性結構端；從韌皮部汁液到莖葉的傳輸過程中，水溶性更強的有機物能更多地從根部傳輸到莖葉，PFOS和PFOA的親水端不同，所以二者的TF不同。同時也有研究發現，植物根系中PFOS、PFOA的累積量與根系蛋白質含量呈顯著正相關關系(P<0.05)，而與根系脂肪含量呈顯著負相關關系(P<0.05)，表明蛋白質對根吸收PFOS、PFOA具有促進作用，脂質具有抑制作用；傳輸因子與莖葉和根中蛋白質含量比例呈正相關關系[25]，說明蛋白質和脂質對PFOS的積累和分布作用不同； 而在PFOA和PFOS聯合作用時，未體現協同作用，只是濃度加和作用，即PFSAs在植物中的傳輸和富集作用機制會因為植物的不同而不同，同時受土壤中有機碳影響。進一步的機制還須要更深入的研究。