水酶法提取牡丹籽油的工藝條件優(yōu)化

張娟，代鑫鵬，周研，李慧靜，王向紅，宋春麗，桑亞新

（河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北保定071000）

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr）屬毛茛科芍藥屬落葉灌木，在我國各地種植廣泛，牡丹籽年產(chǎn)量可達數(shù)萬噸，資源較豐富，極具開發(fā)潛力。近些年，對于牡丹籽的開發(fā)利用也受到了廣泛關(guān)注，研究文獻相應增多。眾多相關(guān)數(shù)據(jù)表明[1-3]，牡丹籽的營養(yǎng)價值高，油脂含量29%～34%，蛋白質(zhì)含量18%～22%，油脂中不飽和脂肪酸含量達90%以上，其中主要為亞油酸和α-亞麻酸。α-亞麻酸和亞油酸作為人體兩種最主要的必需脂肪酸，具有多種活性功能，如降膽固醇、降血壓、預防動脈粥樣硬化、抗疲勞、增強免疫力等[4]。2011年3月22日衛(wèi)生部批準牡丹籽油為新資源食品。

傳統(tǒng)的油脂提取方法主要有壓榨法，溶劑浸提法，隨著油脂工業(yè)的發(fā)展，人們開發(fā)了水代法、水酶法和超臨界CO2萃取法等。其中壓榨法能耗較高，油脂得率低；溶劑浸提法雖然油脂得率高，但此方法存在溶劑殘留；超臨界CO2萃取法對設(shè)備要求較高，且成本高，不利于工業(yè)化發(fā)展；水酶法條件溫和，高效簡單，無污染，無殘留。研究表明[5]，水酶法提油具有良好的開發(fā)利用前景。

本研究采用水酶法從牡丹籽中提取牡丹籽油，以牡丹籽油提取率為指標，采用單因素和正交試驗法優(yōu)選水酶法最佳提取工藝，采用氣相色譜－質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 聯(lián)用分析了所得牡丹籽油的脂肪酸組成，為牡丹籽的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料

牡丹籽：河北圣丹農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司。

1.1.2 試劑

中性蛋白酶 Neutrase 1.5 MG（1.5 AU/g）、堿性蛋白酶 Alcalase 3.0 T（2.4 AU/g）、α-中溫淀粉酶 BAN 480（480 KNU/g）、多聚半乳糖醛酸酶（果膠酶）Pectinex Ultra SP-L（3 200 U/g）、復合纖維素酶Celluclast 1.5 L（700 EGU/mL）：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；氫氧化鈉（分析純）、鹽酸（分析純）、正己烷（分析純）、KOH-CH3OH：天津天力化學試劑有限公司；正己烷（色譜純）：美國Tedia公司。

1.1.3 試驗儀器

JP-500C-6高速多功能粉碎機：永康市九品工貿(mào)有限公司；HJ-2B恒溫磁力攪拌器：金壇市醫(yī)療儀器廠；1000 mL雙層夾套燒杯：上海壘固儀器有限公司；HH-601超級恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；pH計FE20：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；T1000型電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠；FA2004電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；TGL16M型臺式高速冷凍離心機：長沙易達儀器有限公司；Agilent 7890A-5975C氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）、HP-IN-NOWax毛細管色譜柱：安捷倫公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 牡丹籽成分分析

水分含量測定：GB 5009.3-2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》；粗蛋白含量測定：GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》；粗脂肪含量測定：GB 5009.6-2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》；可溶性糖含量測定：苯酚－硫酸法[6]；淀粉含量測定：GB 5009.9-2016《食品安全國家標準食品中淀粉的測定》；粗纖維含量測定：GB/T 5515-2008《糧油檢驗糧食中粗纖維素含量測定介質(zhì)過濾法》；灰分測定：GB 5009.4-2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》。

1.2.2 油脂提取

取30 g牡丹籽粉末（40目）置于夾套燒杯中，加相應量的酶，5倍蒸餾水[7]，調(diào)節(jié)pH值和酶解最適溫度。酶解結(jié)束后，將酶解液高速離心，轉(zhuǎn)速10 000 r/min，時間20 min，收集上層油脂，計算牡丹籽油提取率。

工藝流程：牡丹籽→去殼→粉碎（40目）→加水混合→調(diào)pH值、溫度→加酶酶解→離心→取上層油層→計算油脂提取率。

1.2.3 酶制劑的確定

本研究主要針對復合纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶及α-中溫淀粉酶進行篩選。考慮到成本問題以及后續(xù)生產(chǎn)，從中確定一種提油效果最優(yōu)的酶進行后續(xù)試驗。

1.2.4 提取率測定

1.2.5 水酶法制備牡丹籽油的單因素試驗設(shè)計

為更精確的優(yōu)化出最適條件，本試驗稱取30 g牡丹籽粉，設(shè)定基礎(chǔ)條件為：溫度50℃、pH值為8、加酶量2%、酶解時間4h。每個因素取相應的值進行單因素試驗，并確定每個單因素最佳值所處范圍，根據(jù)這個范圍取相應值進行正交試驗來確定酶解最佳工藝條件。

1.2.6 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選定酶解溫度、酶解pH值、加酶量3個水平為考察因素，采用三因素三水平進行L9（34）正交試驗，每個試驗重復至少3次，以牡丹籽油提取率為指標，確定牡丹籽油水酶法提取的最佳方案，因素水平表如表1所示。

1.2.7 牡丹籽油脂肪酸成分及相對含量分析

甲酯化：稱取提取的牡丹籽油0.1 g于10 mL容量瓶中，正己烷定容至10 mL，于混勻器上震蕩搖勻。取2 mL油樣于10 mL于試管中，加入2 mL KOH-CH3OH溶液在20℃下進行衍生，并在振蕩器上搖勻，反應10 min后，轉(zhuǎn)移至離心管中，在4 000 r/min條件下離心5 min。離心后，取上清液（正己烷層）過0.45 μm有機濾膜后，進行色譜分析[8]。

表1 因素水平表Table 1 The factors and levels

色譜條件：HP-IN-NOWaX19091N－136型石英毛細管柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；載氣為高純度的氦氣（99.999%），柱前壓69.8 kPa；升溫程序為80℃保持8 min，以6℃/min升溫至180℃，保持8 min，再以8℃/min升溫到250℃，保持2 min；載氣流速1 mL/min；分流比 50 ∶1；進樣量 1 μL[9]。

質(zhì)譜條件：質(zhì)量掃描范圍（m/z）40 u～550 u，EI離子源溫度230℃，分辨率1 000，溶劑延遲8 min，傳輸線溫度250℃，電子能量70 eV，四級桿溫度150℃。數(shù)據(jù)檢索庫為NIST 14.L庫[9]，采用峰面積歸一化法計算脂肪酸相對含量。

1.3 統(tǒng)計分析

每個試驗至少重復3次，運用SPSS 17.0、Origin 9.1軟件對牡丹籽油提取率進行進行數(shù)據(jù)分析，并采用主體效應間的檢驗對提取率進行多重比較（P<0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 牡丹籽基本成分分析

牡丹籽基本成分及含量見表2。

表2 牡丹籽基本成分及含量Table 2 The basic composition and content of peony seeds

由表2可知，牡丹籽主要成分為粗脂肪和粗蛋白，其中粗脂肪含量達到29.99%，高于大豆的含量（約19%）[10]，是一種良好的油料作物。

2.2 酶制劑的選擇

參照1.2.2的提取方法，通過預試驗得到各酶制劑的最適pH值和溫度，并在加酶量2%、酶解時間4 h條件基礎(chǔ)上，比較堿性蛋白酶、中性蛋白酶、α-中溫淀粉酶、果膠酶、復合纖維素酶對牡丹籽油提取率的影響，確定適宜酶制劑。如表3所示。

表3 不同酶制劑對牡丹籽油提取率的影響Table 3 Effects of different enzyme preparations on extraction rate of peony seed oil

由表3可知，纖維素酶的效果不佳，雖然它能夠水解細胞壁的主要成分纖維素，但其最適pH值為酸性，此條件下不利于蛋白質(zhì)與油脂的分離。選擇堿性蛋白酶是利用蛋白酶對蛋白質(zhì)水解作用，對細胞中脂蛋白，或由于在粉碎制油工藝過程中，磷脂與蛋白質(zhì)結(jié)合形成的、包絡(luò)于油滴外一層蛋白膜進行破壞，降解脂質(zhì)復合體，減弱油脂與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而促進了油脂釋放[11-12]，大大提高了油脂提取率。試驗證明堿性蛋白酶對油脂提取率較高，且酶制劑的種類直接影響著提取率，堿性蛋白酶的作用效果好也經(jīng)過了相關(guān)報道[13]，所以經(jīng)篩選之后選擇堿性蛋白酶進行后續(xù)試驗。

2.3 堿性蛋白酶影響條件的優(yōu)化

2.3.1 酶解時間對牡丹籽油提取率的影響

在酶解溫度50℃、酶解pH 8.0、加酶量2%的條件下，考察酶解時間對牡丹籽油提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 酶解時間對牡丹籽油提取率的影響Fig.1 Effects of enzymatic hydrolysis time on the oil yield of peony seed

由圖1可知，酶解初期，牡丹籽油脂提取率隨酶解時間的延長呈現(xiàn)上升趨勢，在5 h時提取率達到一個較高水平，之后略有升高，趨于平穩(wěn)。酶解時間長短決定酶對底物作用程度，在反應前期，底物濃度較高，酶的作用有利于破壞細胞結(jié)構(gòu)，促進油脂與其他結(jié)合物質(zhì)分離，提高油脂提取率[14]。另外，長時間的酶解對于生產(chǎn)成本及油脂品質(zhì)都不利。故確定較適宜酶解時間5 h作為后續(xù)試驗條件，該條件下油脂提取率達36.23%。

2.3.2 酶解pH值對牡丹籽油提取率的影響

在酶解時間5 h、酶解溫度50℃、加酶量2%的條件下，考察酶解pH值對牡丹籽油提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 酶解pH值對牡丹籽油提取率的影響Fig.2 Effects of enzymatic hydrolysis pH on the oil yield of peony seed

由圖2可知，酶解pH＜8.5時，牡丹籽提取率呈上升趨勢；pH＞8.5時，隨著酶解pH值增大，油脂提取率下降；酶解pH 8.5時，提取率達最大值37.90%。pH值大于或小于8.5時，不利于其催化活性的充分發(fā)揮，使蛋白質(zhì)的降解受阻，提取率降低，而過高的pH值，還易使油脂皂化，影響牡丹籽油脂品質(zhì)。故確定最適酶解pH值為8.5進行后續(xù)試驗。

2.3.3 酶解溫度對牡丹籽油提取率的影響

在酶解時間5 h、酶解pH 8.5、加酶量2%的條件下，考察酶解溫度對牡丹籽油提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 酶解溫度對牡丹籽油提取率的影響Fig.3 Effects of temperature on the oil yield of peony seed

由圖3可知，在40℃到50℃溫度變化階段，隨酶解溫度升高，牡丹籽油提取率提高；酶解溫度在50℃時，提取率達最高值；酶解溫度繼續(xù)升高，牡丹籽油提取率降低。這是由于酶解溫度較低時，堿性蛋白酶活性低，酶動力反應速率小，隨著酶解溫度的升高，速率增加，提取率顯著升高達37.35%。而過高的酶解溫度會導致酶變性或部分酶失去活性，酶量減少，牡丹籽油提取率降低。故確定適宜酶解溫度為50℃作為后續(xù)試驗條件。

2.3.4 加酶量對牡丹籽油提取率的影響

在酶解時間5 h、酶解溫度50℃、酶解pH 8.5的條件下，考察加酶量對牡丹籽油提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 加酶量對牡丹籽油提取率的影響Fig.4 Effects of the amount of enzyme on the oil yield of peony seed

由圖4可知，在0.5%～2%加酶量范圍內(nèi)，牡丹籽油提取率隨加酶量的增大而不斷提高，這是由于加酶量的提高增加了活性分子間的碰撞機會，加快反應進行，促進了油脂釋放。隨著加酶量的提高，提取率逐漸趨于飽和。由于加酶量的提高會增加生產(chǎn)成本，故確定適宜加酶量為2%進行后續(xù)試驗，此時提取率為38.46%。

2.4 堿性蛋白酶影響條件的正交試驗優(yōu)化

2.4.1 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素的結(jié)果，設(shè)計L9（34）三因素三水平正交優(yōu)化試驗，每個試驗至少重復3次，結(jié)果見表4。

表4 正交試驗結(jié)果分析表Table 4 Orthogonal experiment result analyse

續(xù)表4 正交試驗結(jié)果分析表Continue table 4 Orthogonal experiment result analyse

由表4可以看出，根據(jù)極差R的大小判斷得：水酶法提取牡丹籽油提取率的影響因素的主次順序為：C>B>A，即加酶量>酶解pH>酶解溫度，提取工藝最佳組合為A2B1C3，最佳提取條件為酶解溫度50℃，酶解pH 7.5，加酶量2.5%，牡丹籽油提取率為42.14%。進行了3次驗證試驗，最適酶解條件下牡丹籽油脂提取率平均值為42.08%，綜合分析，可以將A2B1C3確定為最佳提取工藝。

2.4.2 正交試驗方差分析結(jié)果

正交試驗方差分析見表5。

表5 正交試驗方差分析Table 5 Analysis of orthogonal test variance

由表5可知，因素B和C不同水平之間有顯著性差異，說明pH值與加酶量對油脂提取率有顯著影響；因素A無顯著性差異，說明溫度在正交設(shè)計的3個水平對油脂提取率無顯著影響。

2.5 牡丹籽油脂肪酸組成分析

根據(jù)氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀所得質(zhì)譜信息經(jīng)NIST 14.L譜庫定性分析，牡丹籽油離子圖如圖5所示。

圖5 牡丹籽油樣品總離子流色譜圖Fig.5 Total ion chromatograms of fatty acid methyl ester sample

如圖5所示，通過水酶法提取得到的牡丹籽油經(jīng)甲酯化處理后，離子流色譜圖中主要脂肪酸在相應時間內(nèi)出峰。據(jù)出峰時間不同，脂肪酸甲酯依次為棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、α-亞麻酸甲酯。峰響應值最高的為α-亞麻酸，最低為硬脂酸。具體相對含量見表6。

如表6所示，通過GC-MS對水酶法提取牡丹籽油進行了脂肪酸成分分析[15]，結(jié)果表明：牡丹籽油中脂肪酸主要包括5種，分別是：油酸、亞油酸、α-亞麻酸、棕櫚酸、硬脂酸，相對含量分別為26.52%、25.67%、40.04%、6.09%、1.67%，且總不飽和脂肪酸含量達到92.23%。

表6 牡丹籽油脂肪酸組成及其相對含量分析Table 6 Aqueous enzymatic extraction of fatty acid composition and content analysis of peony seed oil

3 結(jié)論

本研究采用水酶法提取牡丹籽油，以牡丹籽油的提取率為指標，采用單因素試驗與正交試驗方法，考察了酶解溫度、酶解pH值、加酶量對牡丹籽油提取率的影響。最終確定牡丹籽油最佳提取工藝如下：提取溫度50℃，pH 7.5，加酶量2.5%，油脂提取率達42.08%，較基礎(chǔ)條件下提高28.12%。牡丹籽油中主要包含棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸5種脂肪酸，總不飽和脂肪酸含量高達92.23%。優(yōu)選的最佳提取方法操作簡單，不飽和脂肪酸的成分含量較高，適合于工業(yè)生產(chǎn)，可為牡丹籽油的綜合開發(fā)利用提供一定的參考價值。