廣州地區(qū)福祿桐葉斑病病原鑒定

傅 昱，許俊寬，游春平

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學院農(nóng)業(yè)與生物學院，廣東 廣州 510225）

福祿桐（Polyscias guifoylei）又名南洋參，原產(chǎn)于太平洋諸島，是五加科南洋參屬（Polyscias）常綠灌木或小喬木。福祿桐株型柔美，枝繁葉茂，葉片與莖干獨特優(yōu)美，葉形多變，葉色也各具不同，生長速度快，耐整形修剪，耐旱耐陰，是近幾年較為流行的高檔室內(nèi)盆栽觀葉植物［1］。近年來福祿桐在我國福建、臺灣及兩廣地區(qū)被廣泛引種與栽培，目前在我國內(nèi)地栽培的福祿桐有9種：羽葉福祿桐、南洋森、線葉南洋森、銀邊圓葉福祿桐、芹葉福祿桐、銀邊福祿桐、圓葉福祿桐、黃斑圓葉福祿桐和紅葉圓葉福祿桐［2］。

隨著福祿桐在內(nèi)地市場的不斷推廣，其種植量也隨之增加，在種植過程中一些病蟲害也相繼發(fā)生。2011年，Nelson等報道了美國夏威夷發(fā)生的福祿桐葉枯病，其癥狀特點是：葉片發(fā)病部位初期呈現(xiàn)不規(guī)則的半透明水漬狀病斑并常有琥珀色的分泌液，病斑后期中部呈棕色，邊緣為黑色，病健交界清晰；病斑沿葉脈發(fā)生，嚴重時導(dǎo)致葉片卷曲變黃后脫落［3］。2014年，廣州市園藝苗圃場發(fā)現(xiàn)有癥狀類似的福祿桐葉斑病發(fā)生，發(fā)病率為10%～20%，嚴重時達30%～50%，廣州園藝苗圃場作為廣州市園藝植物盆栽的重要來源，福祿桐葉斑病的發(fā)生嚴重影響了該苗圃福祿桐植株的觀賞性和經(jīng)濟價值。引起廣州地區(qū)福祿桐葉斑病的病原與Nelson等報道的是否一致還不清楚。本研究通過對病原菌的形態(tài)特征、16S rRNA基因序列以及生理生化性狀的分析，確定病原菌種類，為今后福祿桐葉斑病的防治以及病原菌的致病機理研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料：2015年6月于廣州市園藝苗圃場采集具有典型癥狀的福祿桐葉斑病植株10株，用于病原菌的分離純化和病害樣本的保存，健康供試植株由廣州市園藝苗圃場提供。

培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基和碳源利用培養(yǎng)基參照文獻［4-6］配方配制。

試劑：Hucker草酸銨結(jié)晶紫溶液、Lugol染液、脫色劑、負染溶液、陽性緩沖液及Lugol’s I液等參照文獻［6］配方配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離純化及致病性測定 使用平板劃線分離法［7］對采集的福祿桐病葉進行病原菌的分離，將劃線后的平板置于28℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)48 h后，對平板上的單菌落進行3～5次純化，直到得到一致的單菌落。致病性測定采用針刺法［7］進行接種：用滅菌的醫(yī)用脫脂棉蘸取菌液覆蓋在健康福祿桐植株葉片針刺部位，對照接種無菌水，每個處理5次重復(fù)，于28℃光照條件下培養(yǎng)，48 h后將覆蓋葉片的菌液（或無菌水）去除，對葉片進行保濕培養(yǎng)，每天觀察記錄發(fā)病情況。葉片發(fā)病后，對發(fā)病葉組織再次進行病原菌的分離純化，比較接種后分離菌株與原接種菌株的形態(tài)異同。

1.2.2 病原菌的分子鑒定 將分離到的菌株轉(zhuǎn)接到NB培養(yǎng)液中，28℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)48 h，利用東盛生物科技有限公司的細菌基因組DNA快速提取試劑盒提取菌株總DNA。

PCR反應(yīng)針對細菌的16S rRNA基因，擴增所用引物為 27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-CGGCTACCTTGTTACGAC-3’）［8］。PCR反應(yīng)體系為25 μL：12.5 μL 的2×Taq PCR Green Mix、5 μL的DNA模板、1 μL的引物27F（5 μmol/L）、1 μL的引物1492R（5 μmol/L）、5.5 μL的ddH2O。擴增反應(yīng)程序：94℃預(yù)熱3 min；94℃變性30 s、55℃退火1 min、72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃再延伸7 min；4℃保存。

擴增結(jié)束后將PCR產(chǎn)物送至上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測序。測序結(jié)果利用NCBI進行序列對比，并運用MEGA6.0中的NJ（Neighbor-Joining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展支持率分析采用1 000次重復(fù)。

1.2.3 病原菌生理生化鑒定 參照文獻［9］進行生理生化性狀測定。配制碳源利用培養(yǎng)基，分裝試管并滅菌，待培養(yǎng)基冷卻到室溫時加入經(jīng)過濾滅菌的被測底物（糖醇類底物終濃度為0.5%～1%，其他底物濃度為0.1%～0.2%），再加入100 μL在NB培養(yǎng)液中培養(yǎng)18～24 h的細菌懸浮液。每種碳源試驗設(shè)置3次重復(fù)，對照不加碳源，于28℃搖床培養(yǎng)48 h。連續(xù)接種3代，每一代從上一代的懸浮液吸取100 μL的菌液接種，于相同的條件培養(yǎng)，能生長者表示能利用該碳源。

2 結(jié)果與分析

2.1 福祿桐葉斑病癥狀特點及分離菌株的致病性測定

福祿桐葉斑病發(fā)病初期，病葉出現(xiàn)透明的水浸狀小點，然后逐漸擴大成橢圓形或近圓形，中央褐色，邊緣油漬狀；病斑后期中部呈紅褐色斑點，中部斑點周圍呈黃褐色至黑褐色，病斑邊緣有淡黃色暈圈，病斑直徑約為4～6 mm，病健交界清晰。有些病斑發(fā)生在葉片邊緣或葉片頂部，呈半月形或不規(guī)則病斑，隨著病情加重，病斑繼續(xù)擴大，葉片卷曲而掉落（圖1，封三）。

通過劃線分離法，從發(fā)病組織中分離出6個細菌菌株：FLT1-6，用針刺法將6個菌株分別回接到健康葉片中，保濕培養(yǎng)48 h后，只有分離物FLT4接種葉片出現(xiàn)水漬狀透明病斑，與田間發(fā)病初期癥狀一致，分離物FLT1-3、FLT5-6和無菌水接種的葉片均不產(chǎn)生病斑（圖2，封三）。從接種部位再次分離獲得的分離物形態(tài)特征和分子特征與原接種體FLT4一致。

圖1 福祿桐葉斑病田間發(fā)病癥狀

圖2 分離物回接后福祿桐葉片發(fā)病癥狀

圖3 葉斑病病原菌FLT菌落形態(tài)和革蘭氏反應(yīng)特征

2.2 病原菌株的形態(tài)特征

FLT4在NB平板上于28℃培養(yǎng)2 d后，菌落呈黃色并明顯向上凸起，圓形，邊緣光滑，表面濕潤，易于挑取，不與培養(yǎng)基粘合，產(chǎn)生臭味，培養(yǎng)基無明顯顏色變化，革蘭氏陰性菌，單個菌體為桿狀，菌體大小為1.4～5 μm×0.5～0.6 μm（圖3，封三）。

2.3 病原菌的分子鑒定

利用細菌通用引物27F/1492R對病原菌株FLT4的16S rRNA基因進行PCR擴增，得到片段大小為1 415 bp的擴增產(chǎn)物。將擴增產(chǎn)物序列（GenBank 收錄號：KY982974）在GenBank中進行BLAST比對，并用MEGA6.0按照NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖4）顯示，病原菌株FLT4 與X.campestrispv.vesicatoria（GenBank 收錄號：AM039952.1）、X.axonopodispv.citrumeloF1（GenBank 收錄號：CP002914.1）、X.citripv.strain jx-6（GenBank 收錄號：CP011827.1）、X.citrisubsp.citristrain UI7（GenBank 收錄號：CP008989.1） 和X.citrisubsp.citristrain NT17（GenBank 收錄號：CP008995.1）在同一分支上。

圖4 病原菌株FLT4及相關(guān)菌株基于16S rRNA序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

根據(jù)伯杰氏系統(tǒng)鑒定手冊（第2版）［8］，柑橘黃單胞菌（X.citri）作為一個變種并入地毯草黃單胞菌（X.axonopodis），野油菜黃單胞菌辣椒斑點病致病變種（X.campestrispv.vesicatoria）也歸入到地毯草黃單胞菌（X.axonopodis），既X.campestrispv.vesicatoria和X.citri均為X.axonipodis。

2.4 生理生化鑒定分析

根據(jù)病原菌的分子鑒定結(jié)果，再參照伯杰氏系統(tǒng)鑒定手冊（第2版）［8］對病原菌FLT4的18項生理生化性狀進行測定，結(jié)果（表1）顯示：病原菌FLT4能利用糊精、纖維二糖、乳糖、麥芽糖、6-脫氧-L-半乳糖、D-半乳糖、蜜二糖、丙氨酸、L-丙氨酸和L-丙氨酰甘氨酸與地毯草黃單胞菌（X.axonopdis）一致，相似性達55.56%。

表1 病原菌FLT4生理生化測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

葉斑病是植物葉部較為常見的病害，在糧食作物和經(jīng)濟作物上均有發(fā)生，但引起發(fā)病的病原物卻不盡相同，細菌、真菌、病毒等都可能引起葉斑病［10］。本研究通過對病原菌株FLT4的分離純化和致病性測定，并結(jié)合分子生物學鑒定和生理生化測定初步將引起福祿桐葉斑病的病原菌鑒定為地毯草黃單胞（X.axonopodis）。在本研究中，福祿桐葉斑病病斑為透明的水漬狀，中央有褐色小點，這與Nelson等［3］所報道的夏威夷福祿桐葉枯病病癥類似，但其病斑沿著葉脈發(fā)病和病原物為X.campestrispv.hederae，則與本研究不同，可能的原因是采樣的地點、季節(jié)不同，或存在多種病原菌能引起福祿桐葉斑病的情況。迄今為止，暫未查詢到在廣州有相同或類似的有關(guān)地毯草黃單胞引起福祿桐產(chǎn)生葉斑病的報道，本研究為開展該病的致病機理和抗病機理研究奠定了基礎(chǔ)，為該病的防治提供了參考。

據(jù)報道，X.axonopodis是多種經(jīng)濟作物和糧食作物的病原物，能引起柑橘潰瘍病、木薯細菌性枯萎病、瓜爾豆細菌性疫病、紅掌細菌性葉枯病以及絨果桕屬植物Mabea fi stulifera和巴西胡椒木葉斑病等多種病害［11-16］。其中，由地毯草黃單胞菌萬年青變種（X.axonopodispv.dieffenbachia）引起的紅掌細菌性葉枯病在巴西、美國、荷蘭、意大利、菲律賓以及我國的海南、廣東和云南等地均有大面積發(fā)生，X.axonopodispv.dieffenbachia也被歐洲和地中海植物保護組織（European and Mediterranean Plant Protection Organization, EPPO）列入A2檢疫生物名單之中［14，16-18］；由地毯草黃單胞柑橘致病變種（X.axonopodispv.citri）引起的柑橘潰瘍病是影響全球柑橘種植業(yè)發(fā)展的重大檢疫性病害，其病原菌也是國內(nèi)外的重大檢疫性有害生物［19］。

16S rRNA序列在原核生物中高度保守，對該序列進行測定已被廣泛應(yīng)用于細菌的分類鑒定，其技術(shù)相對比較成熟，但在一些親緣關(guān)系相近的種或同一種內(nèi)不同致病變種的鑒定方面還存在一定的局限性［20-21］。本研究中，基于16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹不能很好的區(qū)分黃單胞菌中不同致病變種的親緣關(guān)系，需通過對病原菌生理生化性狀的鑒定來進一步確定病原菌的種類。但生理生化鑒定結(jié)果很難具體確定到病原菌的致病變種，因此，需進一步對病原菌的特定序列進行測定，并對病原菌的種內(nèi)遺傳分化進行深入研究。