多指標綜合評分法對強筋接骨膠囊提取工藝參數的優化研究*

廖 芳 ，王 歡 ，譚天林 ，陳緯別 ，馬書軍 ，張 丹

1成都市新都區中醫醫院，四川 成都 610500；2西南醫科大學

醫療機構制劑是新藥研發的搖籃，是市售藥品的補充，在臨床治療中發揮非常重要的作用。但醫療機構制劑常存在工藝研究粗糙，生產質量可控性較差等缺點。強筋接骨膠囊是我院名中醫蘭宗煥主任醫師的臨床經驗方，功效為強筋接骨，散瘀止痛，臨床常用于跌打損傷所致的局部疼痛、瘀腫。方中骨碎補苦、溫，補腎強骨，續傷止痛為君藥；川芎辛、溫，活血行氣，祛風止痛；當歸甘、辛、苦、溫，補血、活血，二者共為臣藥。該制劑在我院臨床應用十余年，療效顯著。現擬對該制劑的提取工藝進行進一步研究，擬采用多指標評價正交試驗法對該制劑提取工藝參數進行優化，以提升該制劑的質量控制標準。

1 試藥與儀器

1.1 藥材及試劑 藥材購自四川民康藥業有限公司；對照品柚皮苷(批號：110722-201312)、阿魏酸(批號：110773-201313)均購自中國食品藥品檢定研究院，甲醇、乙腈為色譜純(昌泰興業有限公司)；水為反滲透純化水。

1.2 儀器 Agilent Tcehnologies 1260高效液相色譜儀(G1311C四元泵，G4212B檢測器，G1316A柱溫箱)；色譜柱為Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；AB204-N 型電子分析天平(梅特勒 -托利多儀器上海有限公司)；DL-360型超聲波清洗劑(浙江象山縣石浦海天電子儀器廠)；TC-15型套式恒溫器(海寧市新華醫療器械廠)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件選擇 參考文獻［1］，當歸、川芎的代表性成分阿魏酸及骨碎補代表性成分柚皮苷的流動相中均有甲醇、醋酸溶液，因此，試驗中以一定比例的甲醇、4%的醋酸水溶液為流動相，柱溫35℃，同時檢測柚皮苷和阿魏酸。

以 Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)為固定相，283 nm、321 nm為檢測波長，柱溫35℃，比較以下流動相系統。見圖1。1)甲醇∶4%醋酸水 =19∶81；2)甲醇∶4%醋酸水 =20∶80；3)甲醇∶4%醋酸水 =22∶78；4)甲醇∶4%醋酸水 =23∶77；5)甲醇∶乙腈∶4%醋酸水 =15∶5∶80；6)甲醇∶乙腈∶4%醋酸水 =16∶4∶80

圖1 不同溶劑系統HPLC分離圖譜

結果顯示，系統4)5)6)均有較好的分離度，較好的峰型，經過反復驗證，結合《中醫藥典》方法，確定此次工藝優化液相檢測條件為：以甲醇∶乙腈∶4%醋酸水 =16∶4∶80 為流動相，檢測波長為321 nm和283 nm，柱溫35℃，流速1 mL/min。

2.2 對照品溶液的制備［2-3］柚皮苷對照品溶液制備：取柚皮苷對照品0.012 0 g，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含柚皮苷240 μg的溶液。阿魏酸對照品溶液制備：取阿魏酸對照品0.010 0 g，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含阿魏酸400 μg的溶液。

2.3 線性關系的考察［4-5］精密吸取柚皮苷對照品溶液 0.125、0.625、1.25、2.5、5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度；精密吸取阿魏酸對照品溶液 0.25、1.25、2.5、5.0、10.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加70%甲醇至刻度。

分別吸取上述對照品溶液各10 μL，以甲醇∶乙腈∶4%醋酸水 =16∶4∶80 為流動相，柱溫 35℃，檢測波長為283、321 nm，流速1 mL/min的色譜條件進行測定，以峰面積積分值(Y)對進樣量(X，μg)進行線性回歸，得回歸方程。結果見表1。

表1 直線回歸方程與線性范圍

2.4 精密度考察 取同一供試品溶液10 μL，按上述色譜條件重復進樣6次，記錄其峰面積并計算其RSD，結果表明儀器精密度好。見表2。

2.5 穩定性考察 精密吸取供試品溶液10 μL，在上述色譜條件下，分別于 0、2、4、8、12、24、48、72小時進行進樣，記錄峰面積，計算RSD。結果分析表明，供試品溶液在24小時內穩定。見表3。

表2 精密度實驗

表3 穩定性實驗

2.6 提取工藝優化

2.6.1 正交實驗 為了優化提取工藝，依據預實驗及處方配比，稱取620 g藥材，選擇提取倍量(A)、提取時間(B)、提取次數(C)3個因素，每個因素3個水平，按L(34)正交表安排實驗(提取溶媒為水)。實驗安排表見表4，結果見表5—6。

表4 正交實驗因素水平表

表5 正交實驗結果表

表6 方差分析結果

由表6方差分析得出：影響因素大小為C＞A＞B，提取次數(C)對提取工藝有顯著影響，直觀分析最佳方案為A3B3C3，但經方差分析可知加水量和提取時間各水平間無明顯區別，提取次數2、3水平之間無明顯差異。從節約能源，降低成本的角度出發，故將 A3調整為 A1，B3調整為 B1，C3調整為C2，即 A1B1C2，加水量為 6 倍水，提取時間為 60 min，提取次數為2次。

2.6.2 正交結果驗證 為了進一步驗證上述優選實驗方案的可行性和穩定性，稱取同樣處方量，按上述較佳實驗方案進行實驗驗證，平行3份。見表7。

表7 驗證實驗結果

按選定的提取方法進行驗證試驗，結果顯示3個評定指標較正交試驗中組分偏高表明該提取方法穩定可行。

3 討論

在含量測定中，《中國藥典》所載方法，是針對單一成分，在實際操作過程中，重復操作繁雜，工作量大。參考相關文獻［6-10］。本實驗將方中3味藥材的代表性成分柚皮苷、阿魏酸在同一溶劑系統下進行含量測定，分離度較好，峰形佳，優化該工藝中液相檢測條件，減少操作步驟，降低了工作量。

3.1 檢測波長的確定 本試驗采VWD紫外檢測器，在321 nm檢測阿魏酸，在283 nm檢測柚皮苷，檢測波長設定為各成分的最大吸收處，使上述2種成分均有最大的相應，便于對各組分的含量進行準確測定。

3.2 參考文獻顯示，同時測定多種成分，需要梯度洗脫 本實驗通過對流動相的反復預實驗，未采用梯度洗脫的方法，實現以甲醇∶乙腈∶4%醋酸水=16∶4∶80 為流動相時，阿魏酸在 283 nm 及柚皮苷在321 nm處基線平穩，均有較好的分離度，較好的峰型，靈敏度高。