紅豆杉AFLP分子標記技術體系的建立及應用

史正文

（山西藥科職業學院，山西 太原 030031）

紅豆杉（Taxus）又名紫杉，為紅豆杉科紅豆杉屬植物，是多年生小喬木或灌木，在我國云南、江西、福建以及東北等地都有栽培和野生。紅豆杉在全世界共有11種，我國擁有其中4種和1個變種，即中國紅豆杉（Taxus chinensis）、云南紅豆杉（Taxus yunnanensis）、西藏紅豆杉（Taxus wallichinana）、東北紅豆杉（Taxus cuspidata）、南方紅豆杉（Taxus chinensis var.maire）[1]，其中，中國紅豆杉、南方紅豆杉為我國所特有。從紅豆杉的樹皮、樹根及枝葉中提取的紫杉醇具有很強的抗癌能力，是重要的天然抗癌藥物，尤其在治療乳腺癌、肺癌和卵巢癌等方面療效顯著[2]。因此，作為藥源植物的紅豆杉的種質資源遺傳多樣性研究和種質資源的鑒定就顯得非常重要。

擴增片段長度多態性技術（AFLP）是由VOS等[3]發展起來的一種高效分子標記技術，具有技術穩定、分辨率高、重復性強、可靠性好等特點[4-6]。AFLP被廣泛應用于蔬菜[7-9]、林木[10-11]、果樹[12]、糧食作物[13]、牧草[14]等農作物的遺傳多樣性分析。

紅豆杉屬植物次生代謝產物較多，總基因組DNA提取較難[15]。AFLP分析對供試DNA的要求較高[16]，所以，提取高分子量、高純度的DNA是AFLP分析成功的關鍵之一。

本研究以來自不同種源的紅豆杉為材料，通過優化AFLP反應體系各關鍵影響因素，建立適合紅豆杉的AFLP分子標記體系，為紅豆杉的種質資源遺傳多樣性研究和種質資源的鑒定奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 植物樣品為硅膠干燥后的紅豆杉葉片，來自紅豆杉屬的4個種源和1個變種，樣品保存于山西藥科職業學院藥用植物實驗室。每個種源5個單株的等量葉片混合，用于提取基因組DNA。

1.1.2 主要試劑 RNA酶，Taq DNA聚合酶，限制性內切酶 EcoRI與 MseI，T4DNA 連接酶，dNTP，DL2000 bp DNA Marker等購自上海生工生物技術公司。

1.2 DNA的提取

本研究采用改良后的CTAB法提取紅豆杉基因組DNA，紫外分光光度法、瓊脂糖凝膠電泳法檢測其純度和濃度。具體步驟為：（1）選取超低溫保存的紅豆杉葉片放于研缽中，加液氮用力研磨使之呈粉末狀，迅速稱取0.2 g材料，置于1.5 mL離心管中，并將離心管置于冰中。（2）在1.5 mL的離心管中加入1 000 μL預熱的CTAB提取液（含有PVP（聚乙烯吡咯烷酮）和β-巰基乙醇），使材料完全分散；置于65℃水浴鍋中溫浴30 min，每10 min搖勻一次。（3）將溫浴的材料取出，待冷卻至室溫后加500 μL苯酚-氯仿-異戊醇，搖勻10 min，離心10min（13000r/min），將上清液轉移至一新的1.5 mL離心管中。（4）重復步驟（3）一次。（5）將上清液轉移到一新的1.5mL離心管中，加入0.5倍體積的NaCl和3倍體積的無水乙醇，沉降DNA，輕輕顛倒2～3次，于-20℃冰箱中靜置30 min，離心10 min（13 000 r/min），棄上清液。（6）用 200 μL的 70%的乙醇和無水乙醇各洗2次，加入0.1倍體積的NaAc和2倍體積的無水乙醇，-20℃放置30 min，離心10 min（13 000 r/min），收集得到 DNA 沉淀。（7）待DNA干燥后，加100 μLTE溶液溶解，測定其濃度，而后保存于-20℃冰箱備用。

1.3 AFLP分析

1.3.1 酶切反應 采用MseΙ和EcoRΙ對紅豆杉基因組DNA進行雙酶切，37℃酶切6 h，70℃加熱15 min終止酶切反應，將反應管置于冰上，電泳檢測酶切完全后可進入連接反應。

1.3.2 連接反應 將連接體系與酶切體系混合（共40 μL），20℃連接過夜，得到的連接產物稀釋5倍后作為下一步預擴增的模板。

1.3.3 預擴增 用具有一個選擇性堿基的引物對連接產物進行預擴增。預擴增程序：94℃變性30 s，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，20個循環。預擴增產物稀釋50倍后用于選擇性AFLP擴增反應。

1.3.4 選擇性擴增 確定多態性較好的6對引物進行 PCR：94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s一次循環，然后每循環一次，其退火溫度降低1℃，執行11個循環。在第一階段11個循環以后，94℃30 s，56℃30 s，72℃60 s下執行23個循環后終止反應，得到的選擇性擴增產物進行電泳檢測，確認有條帶出現后，進入聚丙烯酰胺凝膠電泳。

2 結果與分析

2.1 紅豆杉DNA的提取

本研究采用改良的CTAB法提取紅豆杉基因組DNA，提取方法主要進行了以下改進：（1）在CTAB中加人PVP（聚乙烯吡咯烷酮）和β-巰基乙醇聯合除酚。（2）采用高鹽沉淀法代替了異丙醇沉淀法，高鹽沉淀法更適合紅豆杉基因組DNA的提取。（3）采用多次洗滌和高鹽沉淀法相結合的方法，以達到除去多糖的目的。用乙醇沉淀DNA之前，加入0.5倍體積的5 mol/LNaCl；再次溶解洗滌后，用0.1倍體積的3 mol/L NaAc和2倍體積的無水乙醇沉淀DNA。紫外分光光度法檢測所提取基因組DNA的純度，OD值在1.637～1.857。經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），用改良后的CTAB法提取的紅豆杉DNA完整，無降解，能滿足AFLP分子標記分析的需要。

2.2 AFLP程序的優化

在高質量DNA的基礎上，優化了AFLP反應體系。其中，酶切反應體系、PCR擴增反應體系列于表 1，2。

表1 酶切連接反應體系

表2 預擴增和選擇性擴增反應體系

同時，改進了聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的方法。具體改進的步驟為：（1）用6%的凝膠進行電泳檢測。（2）在銀染的過程中，使用超純水可獲得較好的效果；同時要用高純度的氫氧化鈉洗滌，但時間不宜過長，洗滌時間太長，銀顆粒會脫離DNA；染色及顯影溶液臨用前加入甲醛，不能提前加入。

2.3 利用AFLP分子標記對紅豆杉進行鑒定

用8個EcoRΙ引物和8個MseΙ引物組成的64對引物組合對紅豆杉的供試樣品進行擴增，篩選出多態性較好的6對引物對紅豆杉的供試樣品進行AFLP分析（表3），6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結果。結果表明，所采用的6對引物組合中，每對引物組合擴增結果在不同的紅豆杉的供試樣品中表現出豐富的多態性（表4）。從表4可以看出，第1號引物組合E-ACC/M-CTC產生的條帶最多，其中，62.5%的條帶為多態性條帶；第6號引物組合E-AGG/M-CAA產生的條帶最少，多態性檢出率最低，為47.6%。所選6對引物共獲得總條帶數323條，平均每對引物產生約54條AFLP帶，176條均為多態性條帶，多態性檢出率為54.5%。

表3 選擇性擴增的引物序列

表4 紅豆杉AFLP分析多態性情況

3 結論與討論

AFLP技術多態性豐富、靈敏度高、DNA用量少，但對DNA的純度要求較高。紅豆杉的葉片組織含有大量的多糖、多酚及其他次生代謝產物，用CTAB常規方法獲得的DNA純度不高，影響了DNA的酶切和PCR效果。本研究采用改良后的CTAB法，采用PVP（聚乙烯吡咯烷酮）和β-巰基乙醇聯合除酚、高鹽沉淀提取紅豆杉基因組DNA，結果表明，利用該方法得到的基因組DNA，其質量能夠滿足AFLP的要求。

在AFLP分子標記分析過程中，PCR反應體系中各個成分的濃度要根據不同物種進行調整。本研究在對不同濃度成分組合進行試驗后，得到了一個適合紅豆杉的穩定反應體系。聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明，預擴增用1個選擇性堿基，選擇性擴增用3個選擇性堿基，得到的條帶數目適中，適合紅豆杉AFLP分析。在聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中，凝膠的銀染很重要，銀染步驟不適合，得到的條帶不清晰，通過反復實踐，建立了一個優良的銀染體系。

同時，應用建立的AFLP體系，篩選出6對引物組合，在5個紅豆杉種源中共擴增出323條條帶，檢測到176個多態性位點。這些多態性分子標記為進一步研究紅豆杉不同種源間的遺傳差異，保護及開發、利用紅豆杉資源奠定了基礎。