檸條組織培養體系的建立

楊俊鸞

（山西省林木育種研究中心，山西 太原 030031）

檸條（Caragana intermedia）為豆科錦雞兒屬（Caragana）落葉大灌木，適于生長在海拔約900～1 300 m的陽坡、半陽坡，它耐寒、耐旱、耐高溫，是干旱草原、荒漠地帶的旱生灌叢[1-4]。目前，檸條已經成為我國華北、西北及東北西部的固沙造林和水土保持的重要樹種之一，是優良的固沙和綠化荒山植物[5-7]，可作飼草飼料[8-11]。同時，它的根、花、種子均可入藥[12-14]，對滋陰養血、通經、鎮靜及殺蟲等有良好效果[15-17]。

檸條傳統的繁殖方式主要為種子繁殖，但檸條苗木容易受溫度、濕度、地形、地勢、病蟲害等因素的影響，表現為出苗率不高、出苗不整齊等現象[18-19]。但隨著我國經濟發展，檸條植被在生態建設中越來越受到重視，以至于檸條苗木供不應求的矛盾日漸突出。

為了滿足市場對檸條的需求，在實際生產中降低育苗成本，故對檸條進行了組織培養研究。本研究選用檸條莖段作為外植體，KF/MS作為基本培養基加不同比例的激素進行組織培養，對檸條莖段愈傷組織誘導，并進行芽分化、芽的繼代增殖和生根培養，產生新的植株。通過研究其最佳的培養條件，旨在獲得一套高效的檸條組織培養體系，為今后工廠化育苗奠定了理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選用當年生的檸條嫩枝作為外植體，檸條嫩枝采自山西省林木育種研究中心的苗圃地，剪取當年生無病蟲害處于生長旺盛期的檸條嫩枝作為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒方法和初代接種 選取當年生的檸條嫩枝用流水沖洗干凈，將其剪成2 cm左右的莖段（一般要求保留2個左右的腋芽），放入燒杯中，在流水的環境下沖洗30 min，然后用75%的乙醇浸泡搖晃20～25 s，將材料一分為二，一份用0.1%氯化汞浸泡6～8 min，另一份用2%的次氯酸鈉浸泡6～8 min。浸泡中不斷用消毒鑷子攪拌，使外植體充分消毒，然后用無菌蒸餾水沖洗4～5次，即可對莖段進行初代接種，每瓶放1塊外植體，接種15 d后統計污染數，查看消毒效果。

1.2.2 培養基的選擇和培養條件 檸條繁殖采用KF，MS，1/2 MS為基本培養基，培養條件為LED燈光照培養，光照時間12 h，光照強度為2 000 lx，溫度（25±2）℃，濕度70%～80%。

1.2.3 芽誘導培養基中激素濃度的選擇 KF和MS基本培養基中分別加入不同質量濃度的6-BA（0.5，0.8，1.0 mg/L）和 NAA（0.3，0.5 mg/L），接種 30 d后，觀察2種培養基中莖段誘導不定芽分化的情況。

1.2.4 叢生芽增殖培養基中激素濃度的選擇 將分化的不定芽分別接種在不同激素（6-BA和NAA）配比的KF和MS培養基中，6-BA有0.6，1.2，1.5mg/L等3個梯度，NAA有0.2，0.3，0.5 mg/L等3個濃度梯度，參考資料設計最右組合[20]，培養40 d后，觀察不定芽的增殖情況。

1.2.5 根誘導培養基 生根培養基選擇1/2 MS＋NAA0.3mg/L＋蔗糖30g/L＋瓊脂7 g/L，并添加不同含量的活性炭，活性炭含量分別為0，0.3，0.5，1.0，2.0 mg/L。當誘導苗長至5.0 cm時，轉接于上述不同活性炭含量的生根培養基中，研究其對檸條生根的影響。

2 結果與分析

2.1 不同消毒劑和消毒時間對外植體消毒效果的比較

外植體消毒的徹底與否直接影響初代的污染率。對于初代培養，雖然外植體進行了表面消毒，但污染仍在所難免。為了提高無菌材料的獲得率，提高工作效率，初次接種每瓶一般放1塊外植體。由表1可知，2種不同消毒劑的消毒時間都為8 min時，均比消毒6 min的外植體污染率明顯降低。在相同的消毒時間下，用2%次氯酸鈉處理的外植體污染明顯減少，污染率降低；而用0.1%氯化汞處理的外植體污染率較次氯酸鈉處理高。由此可知，檸條外植體用2%次氯酸鈉消毒效果比較好，消毒時間以8 min為宜。

表1 不同消毒劑、消毒時間對檸條外植體消毒效果比較

2.2 不同培養基對檸條莖段誘導不定芽與不定芽生長的影響

接種后的檸條莖段培養30 d后觀察其形成的不定芽數和生長狀況（表2）。接種于MS培養基上有不定芽的形成，誘導率為50%；1/2 MS培養基接種的莖段只有少量的不定芽生成，誘導率只有16%，而且不定芽生長狀態較差，主要是由于培養基中大量元素的減少使植物生長所需的各種元素不足所導致；接種于KF培養基上的有大量不定芽生成，誘導率達到了96%，且長勢良好。所以，選擇KF為最佳誘導培養基。

表2 不同培養基對檸條莖段生成不定芽的影響

2.3 不同激素對不定芽分化的影響

激素種類和激素的濃度顯著影響檸條不定芽的分化效果。在檸條快速繁殖試驗中常用的激素有6-BA，NAA，GA3等[20]。本試驗用不同濃度的6-BA和NAA加入KF和MS培養基中，統計觀察其不定芽的分化以及擴繁能力（表3）。以KF為基本培養基，當 6-BA為0.8 mg/L，NAA為 0.3 mg/L時，不定芽分化最多，分化率為82.5%；以MS為基本培養基時，不定芽分化率低于KF作為基本培養基的分化率，且分化出的芽顏色為淺綠色，部分芽還有玻璃化現象的發生。所以，檸條不定芽分化的最佳培養基是KF＋6-BA 0.8 mg/L＋NAA 0.3 mg/L＋蔗糖20 g/L＋瓊脂7 g/L。

表3 6-BA和NAA組合對檸條不定芽分化的影響

2.4 不同激素配比對叢生芽增殖的影響

以檸條不定芽為試驗材料，在KF基本培養基中加入不同的激素配比進行試驗，對檸條叢生芽分化增殖最佳條件進行篩選。培養40 d后統計產生的叢生芽數量（表4）。結果表明，MS培養基上叢生芽分化個數較少，且萌生慢；KF培養基上叢生芽分化個數較同等濃度的MS培養基多，且植株生長健壯，所以，KF是最佳培養基。誘導叢生芽效果較好的激素組合為6-BA1.2 mg/L＋NAA0.3 mg/L。

由上述結果可知，適合檸條叢生芽增殖的最佳培養基和激素組合為KF＋6-BA 1.2 mg/L＋NAA 0.3 mg/L＋蔗糖20 g/L＋瓊脂7 g/L，增殖率為90%。

表4 檸條莖段叢生芽增殖試驗統計結果

2.5 活性炭對檸條試管苗生根的影響

當檸條無根苗生長至5 cm左右時，將其接種至含有不同含量活性炭的生根培養基中。試驗所用的培養基為1/2 MS＋NAA 0.3 mg/L，經過約20 d培養后，統計檸條生根情況。

表5 活性炭對檸條試管苗生根的影響

由表5可知，活性炭含量為0時，生根率為52%，根系長，但發根晚，且容易褐化，移栽時容易傷根；活性炭含量為0.5 g/L時，生根率為94%，發根早，且根系好、粗壯，移栽利于成活；活性炭為2 g/L時，根系短、發根晚，生根率最低，為46%。這表明活性炭的含量對檸條生根有明顯影響。由此可知，低含量的活性炭不僅能促進試管苗的生根，而且又能吸附培養基中的礦物質和無機鹽，改善培養基的透氣性，有利于根的誘導和生長。所以，檸條生根的最適培養基為1/2 MS＋NAA 0.3 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂7 g/L＋活性炭0.5 g/L。

3 結論

本研究結果表明，檸條莖段培養用2%次氯酸鈉浸泡外植體8 min為消毒最佳時間；誘導愈傷、芽分化和增殖的基礎培養基為KF，愈傷誘導率為96%；芽分化的最佳激素配比培養基為KF＋6-BA 0.8 mg/L＋NAA0.3 mg/L＋蔗糖20 g/L＋瓊脂7 g/L；叢生芽繼代增殖培養基為KF＋6-BA 1.2 mg/L＋NAA0.3 mg/L＋蔗糖20 g/L＋瓊脂7 g/L，增殖率為90%；生根培養基為1/2 MS＋NAA 0.3 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂7 g/L＋活性炭0.5 g/L，生根率為94%。