離體篩選彩葉鳳梨耐羥脯氨酸變異體的研究

崔克強(qiáng)，王彥尊，史華平，王計(jì)平

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，山西 太谷 030800；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801）

彩葉鳳梨（Neoregelia caroline）原產(chǎn)于南美熱帶地區(qū)，花期長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月，可在室內(nèi)常年種植，是近年來(lái)非常流行的室內(nèi)盆花之一[1]，適宜在疏松、肥沃的土壤中生長(zhǎng)，但耐寒性較差。隨著組織培養(yǎng)技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的廣泛應(yīng)用，目前利用化學(xué)誘變技術(shù)與離體培養(yǎng)相結(jié)合篩選抗性突變體的研究越來(lái)越受到人們的重視，已在茄子[2]、紫花苜蓿[3]、小麥[4]、草莓[5]、獼猴桃[6]、楊樹(shù)[7]等植物中篩選到抗性突變體。

烷化劑甲基磺酸乙酯（EMS）是常用化學(xué)誘變劑中效率高且負(fù)面影響較小的誘變劑，能夠引起單一堿基對(duì)發(fā)生改變而形成點(diǎn)突變，應(yīng)用廣泛，突變體表現(xiàn)出的性狀多為顯性性狀，易于篩選，可以為種質(zhì)創(chuàng)新、新品種培育及功能基因組研究分析提供大量基礎(chǔ)材料[8-11]，而且大量研究表明，在化學(xué)誘變過(guò)程中，以羥脯氨酸作為選擇壓力進(jìn)行定向篩選，以提高植物體內(nèi)脯氨酸含量，可以獲得抗性較強(qiáng)的突變體材料[3，12]。

本試驗(yàn)利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)彩葉鳳梨單株試管苗進(jìn)行EMS誘變及抗羥脯氨酸（L-HYP）篩選，進(jìn)而定向篩選獲得抗寒性強(qiáng)的彩葉鳳梨變異體，為彩葉鳳梨的抗性育種提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以株高2 cm左右、長(zhǎng)勢(shì)大致相同的彩葉鳳梨單株試管苗為材料，進(jìn)行EMS誘變處理及抗寒突變體的篩選及鑒定。

試驗(yàn)所用繼代培養(yǎng)基為MS＋KT4.0 mg/L＋I(xiàn)AA 0.5 mg/L，添加瓊脂6 g/L，蔗糖30 g/L，調(diào)節(jié)pH值為5.8～6.0；試驗(yàn)所需光照強(qiáng)度為2 000～3 000 lx，光照時(shí)間為14 h/d，培養(yǎng)溫度均為（25±2）℃。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2015—2016年在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。用0.1 mol/L，pH 7.0的磷酸緩沖液配制不同體積分?jǐn)?shù)EMS溶液，過(guò)濾滅菌，EMS溶液體積分?jǐn)?shù)分別為0.1%，0.3%，0.5%，0.75%，1.0%，以不含EMS的磷酸緩沖液處理為對(duì)照。取預(yù)培養(yǎng)30 d的單株試管苗，用不同體積分?jǐn)?shù)EMS 溶液分別浸泡 4，6，10，24 h 后，硫代硫酸鈉沖洗若干次，再用無(wú)菌水沖洗后，接種于繼代培養(yǎng)基中恢復(fù)生長(zhǎng)、促進(jìn)分化。存活率＝（存活試管苗數(shù)/處理試管苗總數(shù)）×100%；分化率＝（分化不定芽的試管苗數(shù)/處理試管苗總數(shù)）×100%。

將半致死劑量存活的試管苗進(jìn)行繼代培養(yǎng)，經(jīng)5，6，7 mmol/L的羥脯氨酸（HYP）逐級(jí)篩選后進(jìn)行4℃低溫脅迫處理4 h，分別測(cè)定葉片的電導(dǎo)率、超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化物酶（POD）活性等生理生化指標(biāo)，以正常繼代培養(yǎng)的試管苗作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS誘變處理對(duì)彩葉鳳梨試管苗存活率的影響

表1 EMS誘變處理對(duì)彩葉鳳梨試管苗存活率的影響

由表1可知，不同體積分?jǐn)?shù)EMS處理相同時(shí)間，隨著處理體積分?jǐn)?shù)的增加，試管苗的存活率逐漸降低；而相同體積分?jǐn)?shù)EMS處理時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，試管苗的存活率也逐漸降低。將預(yù)培養(yǎng)30 d的試管苗用EMS處理6 h，處理體積分?jǐn)?shù)為0.1%～1.0%時(shí)的存活率分別為 60.0%，53.3%，48.4%，41.9%，12.9%，存活植株較多；EMS體積分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)，單株存活率明顯下降；在EMS體積分?jǐn)?shù)為0.5%，處理時(shí)間為6 h時(shí)，試管苗存活率為48.4%，可以作為半致死劑量，為了避免高體積分?jǐn)?shù)EMS處理對(duì)試管苗造成太大的傷害，繼而導(dǎo)致試管苗生長(zhǎng)受到抑制，EMS使用濃度以不超過(guò)0.75%為佳，故選用0.5%EMS處理彩葉鳳梨試管苗。

2.2 EMS誘變處理對(duì)彩葉鳳梨試管苗分化的影響

將預(yù)培養(yǎng)30 d的試管苗經(jīng)EMS誘變處理后接種在繼代培養(yǎng)基上，以未經(jīng)誘變處理的試管苗作為對(duì)照。從表2可以看出，彩葉鳳梨試管苗的平均分化率隨著EMS使用體積分?jǐn)?shù)及作用時(shí)間的增加呈下降趨勢(shì)。在EMS體積分?jǐn)?shù)為0.5%，處理時(shí)間6 h時(shí)，試管苗的不定芽分化率為36.9%。

表2 EMS誘變處理對(duì)彩葉鳳梨試管苗分化的影響

2.3 突變體篩選

由表3可知，0.5%EMS誘變處理6 h后的試管苗繼代培養(yǎng)30 d，經(jīng)不同體積分?jǐn)?shù)羥脯氨酸（HYP）逐級(jí)篩選后，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的不定芽在5 mmol/L的HYP處理下仍然有62.5%的試管苗存活，當(dāng)處理濃度為6，7 mmol/L時(shí)，不定芽存活率均小于50%；將7 mmol/L處理下存活的植株繼續(xù)在相同濃度HYP處理下繼代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)試管苗全部死亡；而處理組試管苗在不同濃度HYP篩選時(shí)存活植株數(shù)基本都超過(guò)50%，當(dāng)7 mmol/LHYP處理時(shí)，試管苗存活率為46.1%，接近于50%，故選擇濃度7 mmol/L為耐HYP突變體的半致死劑量（表3）。將7 mmol/L濃度HYP處理下存活的試管苗接種到含有相同濃度HYP的培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d，仍然有10株存活，將存活下來(lái)的試管苗進(jìn)行連續(xù)繼代培養(yǎng)3次，用于進(jìn)行突變體的鑒定。

表3 HYP篩選對(duì)試管苗存活率的影響

2.4 突變體鑒定

2.4.1 EMS誘變及HYP篩選對(duì)繼代苗葉片電導(dǎo)率的影響 通過(guò)測(cè)定彩葉鳳梨突變體植株的電導(dǎo)率（以正常生長(zhǎng)的彩葉鳳梨試管苗為對(duì)照），研究在4℃低溫脅迫下植株細(xì)胞膜受傷害程度。由表4可知，在4℃低溫脅迫后電導(dǎo)率會(huì)增加，相比對(duì)照組，經(jīng)過(guò)HYP篩選存活下來(lái)的試管苗，電導(dǎo)率增加幅度較小，說(shuō)明誘變株細(xì)胞膜受傷害程度較小，初步證明其具有較強(qiáng)的抗寒能力。

表4 低溫脅迫對(duì)葉片電導(dǎo)率的影響 %

2.4.2 EMS誘變及HYP篩選對(duì)繼代苗保護(hù)酶活性的影響 由表5可知，經(jīng)過(guò)EMS誘變與HYP篩選的試管苗，在受到低溫脅迫后，植株體內(nèi)產(chǎn)生的SOD含量是對(duì)照植株的1.5倍，POD則是對(duì)照植株的1.34倍，表明通過(guò)EMS誘變處理及HYP篩選能夠提高彩葉鳳梨試管苗SOD，POD的活性，這進(jìn)一步說(shuō)明經(jīng)過(guò)EMS誘變處理后，彩葉鳳梨試管苗抗寒能力有所提高。

表5 低溫脅迫對(duì)保護(hù)酶活性的影響

3 結(jié)論與討論

EMS化學(xué)誘變產(chǎn)生點(diǎn)突變的頻率較高，染色體畸變較少，可以對(duì)植物的某種特殊性狀進(jìn)行改良，是目前應(yīng)用最廣泛、效果最好的一種化學(xué)誘變劑[13]。但EMS在誘變的同時(shí)會(huì)造成生理?yè)p傷，一定范圍內(nèi)，隨著處理濃度和處理時(shí)間的提高，突變效率增加，生理?yè)p傷同時(shí)也會(huì)增大，所以，合適的濃度范圍是誘變成功的關(guān)鍵，一般使用半致死劑量作為最佳處理濃度[8]。本研究選用0.5%的EMS處理6 h時(shí)，存活率為48.4%，接近50%，且處理后試管苗的分化率為36.9%，是比較合適的誘變組合。EMS誘變對(duì)象多為種子[14-15]，但近年來(lái)，隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用，利用誘變與組織培養(yǎng)相結(jié)合的方式創(chuàng)造新種質(zhì)的研究已經(jīng)獲得了很大的成功[4-6]。本研究采用彩葉鳳梨試管苗進(jìn)行EMS誘變處理，獲得了抗寒突變體。

羥脯氨酸是脯氨酸的類(lèi)似物，在誘導(dǎo)突變體時(shí)，采用在培養(yǎng)基中添加羥脯氨酸的間接篩選法，可以獲得抗性較強(qiáng)的突變體植株。曹必好等[16]用60Coγ-射線誘變與高濃度羥脯氨酸離體選擇相結(jié)合的方法，獲得了甘藍(lán)抗性變異體再生植株；李紅等[3]利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)紫花苜蓿愈傷組織進(jìn)行疊氮化鈉（NaN3）誘變及抗羥脯氨酸（L-HYP）篩選，獲得抗性強(qiáng)的紫花苜蓿愈傷組織。本研究采用7 mmol/LHYP篩選突變體，獲得了彩葉鳳梨抗羥脯氨酸的試管苗，并再生培養(yǎng)成抗性植株。

植物在受到逆境脅迫后，體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與消除的動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，活性氧含量增加，加劇了膜脂過(guò)氧化作用，從而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，SOD可以清除細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子，使其轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2；POD則可以將轉(zhuǎn)變?yōu)镺2，清除活性氧對(duì)細(xì)胞的毒害作用，保護(hù)植株抵抗逆境脅迫。本研究對(duì)篩選獲得的突變體植株進(jìn)行4℃低溫脅迫處理，結(jié)果表明，突變體植株的電導(dǎo)率明顯低于對(duì)照，SOD，POD活性顯著高于對(duì)照，說(shuō)明通過(guò)EMS誘變及HYP篩選獲得了誘變植株，且其抗寒能力顯著提高。