胞外聚合物對土壤中苯并芘的降解

甄 凱，單德鑫，歐瑞鵬，趙漢青，郭 玉

（東北農業大學資源與環境學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

多環芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一種普遍存在于環境中的持久性有機污染物，在環境中長期積累會對人類健康和生態環境產生巨大危害，是美國環境保護署公布的優先控制污染物，即便在較低的濃度下也會對動物、人類產生致癌、致畸、致不育作用[1-2]。因此，PAHs污染修復是當前國內外專家學者共同研討的熱點課題，其中，生物修復技術因其處理效率高、降解徹底、不造成二次污染、操作簡單、易行和費用低等優點，愈來愈受到學者們的關注。

胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances，EPS）由微生物細胞分泌，是由多糖、蛋白質和少量的脂類、核酸等構成的有機高分子聚合物質[3]。EPS對微生物細胞表面以及碳源（環境修復微生物中特指污染物）具有重大的影響，甚至是完全取決于胞外聚合物的作用[4]。EPS中包含大量的負電荷官能團，對重金屬離子和有機污染物具有很強的結合能力[5-6]。研究結果表明，在PAHs的生物降解過程中，胞外聚合物可提高降解菌對PAHs的親和力[6]。

迄今為止，還未見有關EPS對土壤中PAHs降解特性的研究報道。因此，本研究選擇苯并芘（benzo[a]pyrene，以下簡稱BaP）為研究對象，它是一種具有5個芳環結構的多環芳烴[1]，由于其化學結構內苯環高度密集、辛醇-水分配系數高，因此，BaP在環境中殘留時間長，較難被微生物降解[7]。

本研究考察EPS對土壤表面BaP降解的影響，旨在為探索污染土壤中PAHs的生物修復機制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 假單胞菌是從中國黑龍江省大慶油田污染土壤中篩選、分離、馴化得來，命名為Pseudomonas sp.DNBe-S1（DNBe-S1）。從 DNBe-S1 的純液體培養物中提取EPS。

1.1.2 供試土壤 土壤樣品采自黑龍江省東北農業大學試驗農場無污染地域的表層（0～20 cm）土壤，為典型的北方黑土。將土壤樣品除去植物殘體及其他雜物，在室溫下自然風干，磨碎并過2 mm篩，備用。

1.1.3 供試培養基 采用了無機鹽培養基，用于DNBe-S1的培養，主要成分有硝酸銨1.0 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、磷酸氫二鈉1.5 g/L、氯化鈉1.0 g/L、七水硫酸鎂0.2 g/L，并添加BaP作為唯一碳源，蒸餾水1 L，pH值7.0～7.2；培養條件為：350℃，1 252 r/min，濕度為40%，培養36 h，取出待用。

1.2 方法

1.2.1 胞外多聚物（EPS）的形態結構觀察 DNBe-S1培養36 h后，取少量樣品，在4℃下以2 000×g離心10 min，除去上清液，用超純水沖洗沉淀物去鹽分，制成懸浮液。取少量懸浮液置于載玻片上制成標本，在ZEISSAxioskop型光學顯微鏡下觀察，使用配置MC80顯微鏡用照相機拍攝。再取少量懸浮液置于蓋玻片上，待其自然風干后直接噴金，然后在JSM-7001F型掃描電鏡下觀察EPS的微細結構。

1.2.2 胞外多聚物（EPS）的提取和組成測定 將培養的DNBe-S1在4℃下以4 300×g離心10 min，除去上清液，用超純水沖洗沉淀物3次，去除其中的鹽分。回收沉淀物并懸浮于超純水中，然后在4℃下以20 000×g離心20 min以分離EPS。通過0.22 μm膜過濾的上清液被認為是DNBe-S1中的粗EPS。將粗EPS通過透析膜（3 500 Da）在4℃透析48 h進行純化，每5 h更換一次超純水。所有低分子量有機化合物和無機離子在該步驟中除去。純化的EPS樣品儲存在4℃直至使用[8]。

純化的EPS樣品糖類測定采用硫酸-苯酚法[9]，蛋白質的測定采用Bradford法[10]。

1.2.3 苯并芘（BaP）在土壤中降解的模擬試驗 將BaP溶解在甲醇中制備成BaP儲備液（0.03mol/L）。準確稱取1 000 g風干土壤樣品，用滴管吸取BaP儲備液加入土壤中，邊加邊混合，并在通風櫥中操作。再用適量甲醇反復沖洗燒杯和轉移用滴管，確保BaP完全轉移至土壤中。待甲醇揮發完全后充分混合土樣，此時土壤樣品中BaP含量為100 mg/kg，置于通風櫥中使其中的甲醇揮發后備用。為了檢驗EPS對土壤中BaP降解特性的影響，處理土壤中分別混合5，10，15 mL的EPS懸浮液，在28℃的恒溫培養箱中避光培養，混合日期視為第0天。并分別在第 0，7，14，21，28，35 天取樣，測定土壤中 BaP 的殘留量，每種處理有3個平行，在整個測試周期內，添加無菌水以保持土壤中的含水量在30%。

1.2.4 土壤中苯并芘（BaP）的測定方法 土壤中BaP的提取和測定按照文獻[11]進行。

2 結果與分析

2.1 胞外聚合物的組成與形態結構

2.1.1 胞外聚合物的組成 DNBe-S1中的EPS主要成分為蛋白質，含量為68%，而多糖含量較低，僅為3.8%。

2.1.2 胞外聚合物的形態結構 Pseudomonas sp.DNBe-S1及其胞外聚合物的形態如圖1所示。從圖1可以發現，圖1-A中細胞外亮光部分為EPS在細菌中的形態，而圖1-B為提取過后的形態。Pseudomonas sp.DNBe-S1為拉絲且含有孔狀結構的聚合物。這樣的結構為EPS吸附BaP并降解提供了良好的先決條件。

2.2 胞外聚合物對土壤中苯并芘的降解

從圖2可以看出，EPS確實可以促進土壤中BaP的降解，未添加EPS的土壤中，第35天，只有20%的BaP被降解。在添加EPS的土壤中，前21 d，土壤中BaP迅速被降解，隨著處理時間的延長，降解速度減慢；并且BaP的降解率隨著EPS添加體積的增加而提高，第35天BaP的降解率從42%（5 mL EPS）提高到 79%（15 mLEPS）。

3 討論

EPS中含有較多的負電荷官能團，較少的正電荷官能團[12]。當微生物接近重金屬或其他污染物時，細胞壁外的EPS首先與它們進行接觸。許多文獻報道，通過靜電相互作用和配位反應，EPS與金屬離子形成配合物[5，13]。因此，有理由推斷EPS在界面作用中可能發揮重要作用，同樣它在PAHs的生物降解中也可能發揮重要作用。EPS與PAHs的良好接觸有利于EPS與PAHs的相互作用。EPS對BaP的降解受到多種因素的影響，如土壤顆粒中BaP的解吸速度。EPS是含有親水部分和疏水部分的兩親化合物，因此，EPS能夠提高疏水物質的溶解性[14]。PAN等[15]研究表明，EPS和菲之間的相互作用是自發的，它們的結合主要是由疏水相互作用決定的。LIU等[16]研究表明，細菌產生的胞外聚合物可以提高土壤中菲的解吸速度。因此，有理由推斷EPS也可以提高BaP在土壤表面的解吸速度。還需要進一步的研究來確定EPS與BaP之間具體存在哪種特定相互作用。此外，由于EPS在土壤中自然存在，因此，EPS在土壤修復應用中將受到越來越多的關注。

4 結論

本研究結果表明，從DNBe-S1中提取的EPS主要成分為蛋白質，EPS可以促進土壤中BaP的降解，并且BaP的降解率隨著EPS添加體積的增加而提高。這將促使人們更多地關注EPS在多環芳烴污染土壤生物修復中的應用。