TLRs受體家族及TLR4受體的功能研究

孔維歡，王晶晶，代蓉，萬鵬程，石國慶

（1.石河子大學動物科技學院，石河子 832000；2.新疆農墾科學院畜牧獸醫研究所，石河子 832000）

0 引言

TLR4（Toll like receptor 4）是最早發現于人類細胞表面[1]的一種與果蠅Toll蛋白同源的Toll樣受體蛋白，也是繼Nusslein-Volhard等[2]研究出決定果蠅胚胎背、腹側分化發育有關的Toll基因受體家族的成員之一[3]。所有的TLRs同源分子都有著相似的結構，屬于Ⅰ型跨膜蛋白受體，可特異性的識別對應的病原相關分子模式[4]（pathogen-associated molecular pattern，PAMP），并在1996年Hoffmann小組克隆出果蠅的Toll受體得以證實有識別并抑制真菌繁殖的能力[5]。最初以為這類天然性的免疫受體只局限于淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、粒細胞、肥大細胞、輔佐細胞等免疫細胞上的表達，然而隨著研究領域的不斷深入，免疫細胞能夠通過PAMP模式對不同的病原微生物及其他抗原類大分子進行識別、結合，并誘發一系列信號轉導功能進而促進各種免疫因子和激素的釋放，最終建立起獲得性免疫系統。因此，近年來的研究認為營養性肥胖[6]、動脈粥樣硬化、心肌梗死、哮喘等疾病所引起的非細菌性炎癥反應以及部分癌癥瘤細胞等都與TLR4有關或者都有TLRs表達。同時，TLRs在人和其他哺乳類動物的生殖免疫方面也發揮著重要的作用，但作用機制并不十分明確。

1 TLRs受體的結構特點與信號轉導

自從Janeway和Lemaitre等人最早發現與果蠅Toll蛋白同源的人類Toll蛋白及編碼的TLR4受體之后，人們相繼在小鼠體內發現了13種TLRs[7]以及確定人類及其他哺乳類動物體內有10種TLR[8-10]。TLR作為一種I型跨膜蛋白，它是由胞外區、跨膜區和胞質區3部分構成，其中胞外含有15～29個亮氨酸重復序列（LRR）組成以輔助識別病原體微生物及其產物，也可與CD14分子中的亮氨酸重復序列結合而介導蛋白質之間的相互作用。胞內由一段與IL-1受體胞內區的保守序列具有高度同源性的TIR結構域和跨膜結構域構成[11]，并且TIR含有的3個高度保守區能夠在TLRs和信號傳導銜接蛋白的蛋白質中發揮著重要的作用[12]。不同的TLRs可使用不同的銜接蛋白來確定下游的信號傳導通路，TIR結構中有MyD88、TRIF相關銜接蛋白、含TIR結構域的銜接蛋白、誘導IFN-β的含結構域的銜接蛋白和含sterilea與HEAT-Arma dillo基序的銜接蛋白等5種銜接蛋白。而TLR4恰好是至今發現的唯一一個可以使用這5種銜接蛋白的Toll樣受體家族成員[13]。

20世紀90年代后期，越來越多的TLRs受體家族的受體基因及其配體被發掘以來，科學家們對天然免疫的的認知逐漸由一種非特異性免疫應答轉變為具有特異性的應答反應。TLRs分布十分廣泛，主要表達于巨噬細胞、淋巴細胞等天然免疫細胞及內皮細胞和上皮細胞的表面，是架接非特異性免疫和特異性免疫的重要橋梁[14]，尤其體現在TLRs胞內區保守的TIR結構域。當TLRs通過PAMPs模式識別不同的病原大分子后，其特異性反應信號轉導就取決于TLRs的TIR功能域與下游接頭分子的TIR功能域是否能夠發生特異性相互作用，例如其結構功能域特異募集的下游接頭分子MyD88/TRIF相關銜接蛋白就是信號通路活化的關鍵步驟。

TLRs受體家族有MyD88依賴型TLR信號轉導通路和MyD88非依賴型／TRIF依賴型信號轉導通路，顯然在這2種信號轉導方式中MyD88是一個關鍵的接頭蛋白，且在大多數TLRs信號傳導中有著重要的作用。例如：在TLR2、TLR5、TLR7、TLR9[15]信號傳導途徑中，若有MyD88銜接蛋白的缺陷就會導致信號傳導受阻。而TLR3和TLR4是2個比較特殊的Toll樣受體，TLR3主要介導MyD88非依賴型信號轉導通路，當然MyD88也可以在TLR3的負調節中發揮功能[16]，TLR4則可以同時介導這2種傳導途徑（如圖1）。2種不同的信號傳導途徑通過不同的通路，分別經過一系列的信號傳導鏈激活NF-kB，AP-1或IRF-3等轉錄因子，最后進入細胞核調節炎癥因子、細胞因子、共刺激分子和細胞增殖、凋亡等基因的表達，從而啟動先天性免疫和獲得性免疫系統[17]。

圖1 TLRs的信號通路傳導示意

2 TLRs的配體識別功能

TLRs有外源性和內源性2種配體，外源性配體主要為LPS（革蘭氏陰性菌脂多糖成分）、肽聚糖以及多種細菌和病毒的核酸等病原微生物類物質。不同的PAMP可被不同組合類型的TLR識別，如定位于細胞膜上的TLR1、TLR2、TLR4-6受體能夠識別病原體的脂肽、多糖、鞭毛和脂蛋白等；定位于細胞內室質膜結構的TLR3、TLR7-9則能識別病原體雙鏈RNA、單鏈RNA、病毒單鏈RNA和DNA。而內源性配體則主要是在機體應激或者組織損傷時，宿主細胞所釋放的熱休克蛋白和胞外基質的降解成分。

當然，不同受體與配體之間的結合并不是固定不變的，它們之間或多或少也有著必然的協作調控關系。例如，在人類免疫應答過程中TLR1、TLR2、TLR6主要參與識別分枝桿菌和革蘭氏陽性菌，但有些PAMPs模式的識別只需TLR2參與，如脂磷壁酸。另外，TLR2和TLR1、TLR6又有相互協作的關系[18]。譬如，①配體與TLR2結合可誘發TNF-α的產生，但是誘發反應又會受到TLR6的抑制。②TLR6與TLR2因表達形成的異二聚體結構對TLR2的各種配體能夠進行模式識別激活細胞內的信號傳導通路，進而產生的細胞因子能夠使TLR2的識別更加廣泛，同時也增強了TLR2所介導的反應。此外，因TLR6和TLR1在結構上有著高度的同源性，所以在某些情況下能夠補償TLR1功能上的不足之處[19]。TLR4除了能夠識別LPS等微生物來源的外源性配體外，還有許多其他配體：分支桿菌的表面抗原、脂質體A類似物、呼吸道合胞病毒融合蛋白和熱休克蛋白、纖連蛋白等內源性蛋白[20]。有病毒中的相關研究表明，TLR7和TLR8是TLR9的亞家族成員，在結構上有著高度的同源性。其中TLR7和TLR8識別的單股負鏈RNA病毒是鼠類中該受體的主要生理配體；TLR9則是識別未甲基化的CpG DNA，與之結合激活樹突細胞產生免疫因子IL-12，從而誘發免疫應答反應[21]。TLRs受體家族的其它成員，如TLR10-13等配體識別與作用尚不明確，也未發現與其結合的特異性抗體。

3 TLR4受體功能的研究進展

TLR4是第一個被發現于人類細胞表面的TLRs受體蛋白，也是TLRs家族中最復雜，研究領域最為廣泛的成員，幾乎分布于所有的細胞內，表達于各種組織細胞。由于有著特殊的識別結構和My D88依賴/非依賴性信號轉導通路，使得TLR4不僅有著天然的免疫反應，還與腫瘤癌癥發生機制和胚胎發育、妊娠疾病等方面有著直接或間接的關系，并發揮著不同程度的作用。

3.1 TLR4受體在腫瘤生長中的作用

近年來研究表明，慢性炎癥是惡性腫瘤發生、發展的重要因素[22]，超過l5%的惡性腫瘤與慢性炎癥有著直接的關系。而且最初認為的TLRs只表達于免疫細胞是有局限性的，現在越來越多的科學數據表明絕大多數惡性腫瘤細胞能夠表達不同的TLRs[23]，提示了TLRs在慢性炎癥的致瘤機制中有著重要的作用。其中TLR4在腫瘤細胞中呈高表達狀態，與多種腫瘤的發生、發展密切相關，因而TLR4在腫瘤發生發展中的作用機制備受關注[24-26]。

3.1.1 腫瘤細胞的遷移與浸潤

腫瘤細胞中活化的TLR4不僅能夠促進細胞增殖、抑制細胞凋亡，而且還能促進癌細胞的遷移、浸潤以及血管生成[27]，并且血管生成可以在腫瘤的生長、侵襲和轉移中發揮重要作用這一重大發現已被證實[28]。另外，腫瘤細胞中受體蛋白的激活誘導了促炎癥細胞因子和免疫抑制分子的產生，為腫瘤細胞抵抗細胞毒性淋巴細胞的攻擊起到了協同作用，導致了腫瘤的免疫逃逸。但其促腫瘤的明確機制尚不完全清楚[29]。

TLR4能識別不同的PAMP外源性分子和DAMP內源性分子（損傷相關分子模式）并與之結合，從而激活TLR4信號傳導通路。兩條不同的依賴/非依賴性途徑最終活化了NF-kB和MAPK通路，誘導了前炎性分子的表達和I型干擾素及干擾素相關基因的轉錄，IFN-10、GARG-16、INF-1的表達和樹突狀細胞（DC） 的成熟[30]，從而促進抗病毒和抗細菌免疫。故此，NF-kB的激活能夠直接促進多種腫瘤的發生與發展，是慢性炎癥致瘤的重要因素。例如在消化系統腫瘤中，TLR4能夠在胃癌組織以及胃上皮細胞或者形態異常的組織中表達異常升高活化NF-kB[31]，進而炎性因子COX-2、PGE2（前列腺素E2）的表達呈現上調趨勢，最終導致正常的胃上皮細胞發生癌變。同樣的，與人和小鼠慢性結腸炎有關的結腸腫瘤組織也有TLR4的高表達，并且體內外相關實驗均已證實TLR4在炎性相關的結腸癌生成中發揮了作用。這也說明了TLR4對結腸癌的促進作用依賴于COX-2、PGE2的表達及EGFR （表皮生長因子受體）信號的活化[32]。

3.1.2 腫瘤細胞的增殖和凋亡

腫瘤生長是細胞增殖和凋亡之間動態平衡的一個調控過程，LPS等配體使得TLR4信號通路激活后活化了NF-kB，分泌出一些抗凋亡因子和蛋白，如Bcl-2家族蛋白、凋亡抑制因子-1等，并參與腫瘤的生長，形成對腫瘤產生凋亡抵抗的免疫反應[33]。例如，臨床醫學中常見的腫瘤切除手術后的繼發性瘤細胞生長迅速擴散現象，其原因可能是：手術時空氣中或者腸道內的LPS、細菌內毒素等大分子進入腹腔和循環系統導致了免疫狀態的改變，從而通過調控增殖、凋亡平衡以及上調等相關因子促進了轉移灶內癌細胞的生長[34-35]。在慢性炎癥為特征的腫瘤微環境內，癌細胞中信號的激活促進了細胞的生長和遷移。如：前列腺癌細胞組成性表達TLR4，LPS刺激能上調免疫抑制因子TGF-β1，促進腫瘤的免疫逃避，同時增加促血管生成因子VEGF的分泌，促進細胞存活、增殖及轉移；在膀胱癌中，TLR4信號激活后分泌IL-6，促進了腫瘤的進化；肺癌細胞中TLR4信號激活后能抵抗TNF-α 或TRAIL誘導的細胞凋亡[36-38]。另外，癌細胞中TLR4信號激活后，通過分泌粘附因子整合素Integrin-β1等促進了癌細胞與細胞外基質和內皮細胞的粘附，進而分泌蛋白水解酶降解基質和基底膜，使得癌細胞發生浸潤和轉移。

腫瘤的發生、發展和轉移都與腫瘤微環境內腫瘤細胞、免疫細胞、DAMPs以及PAMPs的相互作用有關，同時也充分說明TLR4與細胞增殖、細胞分化、細胞遷移和細胞調亡有直接或間接的關系。但其具體機制復雜多樣，尚未完全明了。

3.2 TLR4受體在生殖免疫中的作用

雌性哺乳動物生殖道是一個與外界環境相通的開放系統，有著特殊性。其能夠產生的免疫反應是生殖器官及組織抵抗細菌、病毒、真菌等病原微生物的第一道防線，對免疫機制有著獨特而嚴格的要求，并且受各種內分泌激素尤其是性激素的影響十分顯著。例如，子宮就是受雌激素、孕激素影響的典型器官，在妊娠期間由于受體內高水平孕激素的影響子宮內膜生理結構變得更加疏松，像肥沃的土壤一樣給胚胎提供了適宜的滋養生長條件。

3.2.1 TLR4受體在子宮中的表達

目前越來越多的國內外學者對雌性哺乳動物生殖免疫產生了興趣。雌性生殖道—子宮通過免疫機制阻止病原微生物的入侵，從而維持了其正常的生殖機能。在天然免疫受體中TLR4在機體天然免疫對病原微生物的識別方面發揮著非常重要的作用，也是TLRs家族中研究最為廣泛的受體。TLR4活化后將誘導產生一系列的炎癥介質而發揮強有力的炎癥反應，也是架接先天性免疫和獲得性免疫的重要橋梁。因此，TLR4可作為一種重要的免疫因子，參與子宮內膜的局部免疫調節。在Pioli、 Nishmura等人[39-40]相關的研究中發現人類的卵巢，輸卵管以及子宮中檢測到了TLR1-10的表達，并呈現差異性。另外，用熒光定量RTPCR方法也發現了妊娠老鼠子宮、子宮頸、胎盤等生殖組織中TLRs mRNA的表達成規律性變化。同樣，2009年張高英[41]研究發現TLR4在不同時期母豬子宮中有差異性表達，且主要表達于子宮內膜上皮細胞，提示子宮免疫系統中的免疫因子隨生理、病理狀態發生變化。

3.2.2 TLR4受體在子宮內膜中的調控

在雌性哺乳動物健康生殖周期中，子宮中的TLR4也會被無菌炎癥所激活[42]。因此，TLR4在子宮內膜中的表達可能意味著在生殖周期中出現了無菌性炎癥。通過免疫組化發現，在卵泡期和黃體期，子宮內膜基質細胞TLR4的表達要比表皮細胞更加強烈[43]。同樣，在人體基質細胞中TLR4的表達比表皮細胞更加強烈。TLR4通過PAMP機制模式識別LPS涉及到CD14 、MD2兩個配基結合元件輔助性蛋白分子。其中，已被證實CD14能夠表達于子宮內膜基質細胞的上皮，而在內膜上皮細胞不表達。Hirata等還發現TLR4在膀胱和腸道上皮細胞中能夠被激活并表達，并且還抑制了大多數病原微生物引起的炎癥反應，進一步夯實了除非加入可溶性CD14，TLR4在上皮細胞中才可能識別LPS。基質細胞中本含有可以識別LPS的膜狀CD14，若缺少膜狀CD14，可能會防止上皮細胞對病原體產生過度免疫反應。相反，在上皮細胞屏障被突破時，基質細胞能立即作出反應[43]。因此TLR4在子宮內膜基質細胞中的表達比上皮細胞中活躍，這與TLR4，CD14和MD2的mRNA在上皮細胞中的表達量比基質細胞低的結論是一致的。然而在牛科動物的子宮內膜上皮細胞和基質細胞中均有CD14蛋白的表達，這一結果作為CD14 mRNA表達的補充顯示出了物種的差異性[44]。

目前，隨著生殖內分泌免疫調控學的發展，激素與免疫系統之間的相互調節、相互影響的作用機制成了研究熱點。子宮作為機體與直接外界環境相通的生殖器官，其免疫系統有著獨特而嚴格的特殊性，同時具有一套防御感染的局部免疫機制。子宮既能發揮局部免疫反應抵抗病原微生物感染，又能對胎兒產生免疫耐受，從而提高了胚胎著床率并保證了妊娠期內環境的穩定性。

4 結束語

TLR4受體及其家族成員都有著不同的配體分子，參與天然的免疫反應，能夠通過本身具有的特殊結構域識別各自的配體引起一系列信號轉導通路，釋放各種免疫介質，進而建立起獲得性免疫系統。目前，TLR4在豬、牛、羊、小鼠以及人類等都有廣泛的研究，尤其是在臨床醫學和生殖免疫學方面。TLR4不僅能夠調控腫瘤細胞的遷移與浸潤、增殖與凋亡，還能促進血管的生成。在生殖組織器官中更有差異性的表達。故此認為，TLR4受體可能在哺乳動物胚胎期和個體生長發育過程中發揮一定的作用，經前期課題研究發現TLR4在綿羊胚胎附植期子宮內明顯有差異性表達，且在子宮內膜基質細胞內呈現免疫陽性反應。

隨著區域性經濟發展，新疆的畜牧業規模發展越發成熟，對牧民的生活質量和經濟收入提供了可靠的保障來源，也對整個畜牧業的發展起到了促進作用。為了能更好的發展反芻動物的生產量滿足國內市場需求，我們可以把TLR4做為妊娠繁殖過程中的候選基因，深入研究TLR4基因在胚胎附植方面的調控機制，以提高胎兒著床發育成功率乃至出生的成活率。從而能夠在生產實踐中得到推廣和應用。