高原型牦牛口蹄疫快速診斷技術(shù)及三價疫苗效果分析

祁玉琴

（青海省海西州天峻縣新源鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，海西 817299）

0 引言

牛口蹄疫危害嚴(yán)重，國際上各個國家也采取不同有效措施對疫情進(jìn)行有效防控。我國自建國以來曾經(jīng)爆發(fā)過5次大規(guī)模的口蹄疫，主要為A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒暴發(fā)流行。進(jìn)入21世紀(jì)，亞洲一型口蹄疫病毒在我國境內(nèi)呈現(xiàn)高發(fā)趨勢，因此，需要對現(xiàn)有的疫苗進(jìn)行有效的改良，研制保護(hù)性能更強(qiáng)的疫苗。

1 快速診斷技術(shù)

目前，高原型牛口蹄疫快速診斷技術(shù)，主要應(yīng)用抗體檢測試劑盒開展檢測。在具體操作過程中，要嚴(yán)格按照抗體檢測試劑盒的說明要求開展，具體內(nèi)容如下。

1.1 試劑盒操作

第一，對樣品進(jìn)行稀釋處理。在處理過程中，按照試劑盒中的使用說明書科學(xué)稱量試劑，使用標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行嚴(yán)格稀釋，并將稀釋液作為陽性對照；第二，試劑盒加樣。在操作過程中，設(shè)置了空白對照孔，標(biāo)準(zhǔn)孔和待檢樣品孔。準(zhǔn)確標(biāo)定50 uL樣品，將其添加到酶標(biāo)包被板，首先將稀釋液40 μL滴加到待檢樣品的樣品孔中，然后向該孔中再加入稀釋液10 μL。用模板封裝之后，放置于恒溫保溫箱內(nèi)培育30 min，恒溫箱內(nèi)的溫度，持續(xù)維持在37 ℃。在恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)過程中，選擇使用30倍的濃縮洗滌液，使用經(jīng)過滅菌處理的蒸餾水，30倍稀釋；第三，上述培養(yǎng)結(jié)束，將試劑盒的模板取出，將多余的反應(yīng)溶液去除，充分干燥，在向每一個反應(yīng)孔中加入洗滌液，作用30 s后將洗滌液移出，如此反復(fù)5次。然后選擇使用酶標(biāo)試劑，除了普通白孔不添加之外，其他各個孔加入50 uL。然后按照上述培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間培養(yǎng)后向其中加入濃縮液洗滌；第四，顯色反應(yīng)。在上述處理的培養(yǎng)物中加入顯色劑，每個反應(yīng)孔中先加入顯色劑A，然后再加入顯色劑B，每一個反應(yīng)孔中各加入50 uL，充分混合之后，在適宜溫度下，遮光培養(yǎng)15 min；第五，測定。選擇450 nm的光波，分別測定各個反應(yīng)孔的吸光度，在整個測定過程中，應(yīng)該確保在添加終止液15 min內(nèi)完成。

1.2 結(jié)果判定

根據(jù)試劑盒的操作說明，進(jìn)一步判定試劑盒內(nèi)的反應(yīng)情況。如果抗體效價大于0.2，則判定為陰性；如果抗體效價維持在0.2～0.3之間，判定為可疑；如果抗體效價不小于0.3，則判定為陽性。在進(jìn)行判定過程中，針對檢測過程中發(fā)現(xiàn)的陽性樣本和可疑樣本，應(yīng)該設(shè)置重復(fù)檢驗，復(fù)檢驗結(jié)果仍然為陽性的，才能判定為陽性。

2 三價疫苗免疫效果調(diào)查

2.1 材料與方法

2.1.1 試驗材料選取

研究選擇在青海省海西州天峻縣新源鎮(zhèn)3家牦牛養(yǎng)殖場進(jìn)行。在3家養(yǎng)殖場中分別挑選不同年齡性別的牛，同時要保證牛為6月齡以上健康牛。疫苗選擇由新疆天康畜牧生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的口蹄疫A型、O型和亞洲一型三價滅活疫苗。實驗過程中主要使用到洗板機(jī)、酶標(biāo)儀、量程加樣器、超純水、無離子水、包被緩沖液、洗滌液及底物溶液。

2.1.2 操作方法

首先，選擇使用緩沖液，將與上述疫苗相對應(yīng)的血清，稀釋到指定的濃度，然后在設(shè)計板上，每個樣孔中加入血清50 uL，密封后室溫環(huán)境內(nèi)作用一晚上[1]。將3個養(yǎng)殖場采集的待檢血清56 ℃環(huán)境下滅火30 min；其次，抗原抗體反應(yīng)。選擇使用優(yōu)型血凝板，按照每孔50 uL的用量，使用稀釋液將20個待檢血清從1∶16開始做2倍連續(xù)稀釋，直到稀釋滴度控制在1∶128。按照上述方法，將陰性血清和陽性對照血清稀釋，在試劑盒的每一個孔中加入50 uL經(jīng)過稀釋到指定濃度的3種口蹄疫病毒抗原，同時在對照孔中，加入100 uL的病毒抗原，充分混合后，指定環(huán)境下密封培養(yǎng)24 h。確保加入病毒抗原后，是1∶32稀釋度的兩倍；再次，將反應(yīng)平板用緩沖液反復(fù)清洗5次，干燥之后，將反應(yīng)物依次轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的孔中，然后向孔中滴加50 uL反應(yīng)液，37 ℃溫度下密封1 h。然后使用洗滌液，用緩沖液反復(fù)清洗5次，干燥之后，使用豚鼠抗血清進(jìn)行充分稀釋，稀釋亞洲一型口蹄疫病毒，直到稀釋到1∶1000的工作濃度，每個孔中加入50 uL，37 ℃密封培育1 h，按照上述操作方法使用稀釋液將其稀釋到1：1000的工作濃度，每孔加入50 uL，37 ℃密封培育1 h；最后，每孔加入50 uL底物溶液，37 ℃培養(yǎng)15 min，然后向其中再加入50 uL終止液，終止反應(yīng)，立即在波長492 nm下讀取其吸收值（OD值）。

2.1.3 判定

以口蹄疫病毒抗原對照平均OD值的50%為臨界值[2]，被檢血清大于臨界值為陰性，小于或等于臨界值為陽性。陽性孔OD值使所對應(yīng)的稀釋度為該份血清的抗體滴度，如果臨界值處于兩者之間，取中間值。當(dāng)牛的抗體效價不少于1∶128時，屬于99%以上保護(hù)，抗體效價不大于1∶16時，屬于不保護(hù)范圍，需要進(jìn)行基礎(chǔ)免疫。抗體效價在1∶22到1∶90時，屬于50%保護(hù)范圍，需要強(qiáng)化免疫[3]。

2.2 結(jié)果

通過對青海省海西州天峻縣新源鎮(zhèn)3家牦牛養(yǎng)殖場122只免疫的牦牛定期采取血清進(jìn)行免疫抗體滴度變化檢測可以看出（見表1），牛群在免疫第1個月A型、O型和亞洲一型抗體滴度分別達(dá)到了1∶556，1∶129，1∶289，免疫第6個月后，除了亞洲一型抗體之外，A型和O型口蹄疫免疫抗體水平均高于免疫前。抗體滴度分別為1∶105，1∶99，1∶64。通過表1數(shù)據(jù)可以看出，口蹄疫A型、O型和亞洲一型三價滅活疫苗有效免疫期在6個月以內(nèi)具有很好的免疫效果，但對于亞洲一型口蹄疫發(fā)生的地區(qū)，在免疫第6個月后，需要進(jìn)行強(qiáng)化免疫。

表1 三家牦牛養(yǎng)殖場抗體滴度變化

通過對青海省海西州天峻縣新源鎮(zhèn)3家牦牛養(yǎng)殖場抗體滴度變化監(jiān)測分析可以發(fā)現(xiàn)，口蹄疫A型、O型和亞洲一型三價滅活疫苗免疫之后1～2月抗體滴度幾何均值最高，免疫3月后100%的牛A型抗體水平達(dá)到100%免疫保護(hù)率，80%以上牛O型和亞洲一型抗體達(dá)到100%免疫保護(hù)率。免疫6個月后，口蹄疫A型、O型和亞洲一型均不小于1∶64。由此可以看出，所使用的三階滅活疫苗能夠起到令人滿意的保護(hù)效果。