薄荷中L-薄荷醇的抗驚厥活性研究

姜圓圓,趙 巖,*,王士杰,郜玉鋼,劉雙利,楊 鶴,張連學

(1.吉林農業大學中藥材學院,吉林長春 130118;2.吉林農業科技學院中藥學院,吉林吉林 132101)

唇形科薄荷屬植物薄荷(MenthahaplocalyxBriq.),又稱水益母,為廣泛種植的宿根性草本植物;其莖葉具有清涼的芳香氣味,沁人心脾;是一種兼具觀賞與藥用價值的經濟作物。作為中藥,薄荷疏散風熱,清利頭目,利咽,透疹,疏肝行氣;用于風熱感冒,風疹,麻疹,胸脅脹悶等癥[1]。薄荷中含有多種萜類、黃酮類、有機酸類等天然成分;此外薄荷富含揮發油——薄荷油,其主要成分為一種單萜類成分——L-薄荷醇(又稱薄荷腦),含量可達62%～87%[2];L-薄荷醇具有加強中樞抑制、清涼止癢、利膽、促滲透、消炎止痛等多種藥理作用[3]。

癲癇是一種以反復發作為特征的慢性神經性疾病,常伴有認知缺陷和情緒障礙,在人類的全年齡段均具有較高的發病率。由于癲癇發作是大腦中不可控的神經興奮的結果,所以癲癇一直被認為是神經疾病。據估算,全世界有5000萬人患有癲癇,其中85%的病例集中在低收入和中低收入國家[4],大約有20%由于服用抗癲癇藥產生嚴重的副作用,還有約30%的難治性癲癇患者無法獲得治療[5]。在對癲癇發生和發展的研究過程中,產生了新的治療觀點,即以有效地預防癲癇發作為主要治療目標。癲癇持續狀態是一種急重癥,可以發生在各種類型的發作形式上,如驚厥性的癲癇持續狀態和非驚厥性的癲癇持續狀態,其中驚厥性癲癇持續狀態可能嚴重至危及生命[6]。許多抗癲癇藥即是試圖降低癲癇發作,靶向神經元離子通道、γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸受體一直是消除癲癇發作的主要關注點,常規的抗癲癇劑(苯妥英和卡馬西平)和新型的抗癲癇藥(加巴噴丁、氨己烯酸和羅雷利唑)具有嚴重的副作用[7-8]。有30%的患者對這些藥物具有耐藥性[9]。因此,新的抗驚厥藥物的發現以降低癲癇導致的癥狀顯得極為緊迫。

中醫藥治療癲癇有著幾千年的歷史,中醫理論認為驚厥屬“癇病”,病機與肝的疏泄失常密切相關[10]。《本草述》記載薄荷可治癲癇,去高顛,醫治小兒驚狂壯熱。薄荷油(主要含L-薄荷醇)通過吸嗅可以調節中樞神經系統中γ-氨基丁酸和谷氨酸類神經遞質含量[11]。有研究表明薄荷醇可以調節腦導水管周圍灰質(PAG)中GABA受體的突觸和突觸群體,降低印防己毒素對氯離子通道的影響[12]。但截止目前,尚缺少L-薄荷醇抗癲癇的實驗數據及作用機理的相關文獻報道。因此,該文對薄荷中的有效成分L-薄荷醇的抗驚厥活性及其潛在的作用機理開展了實驗研究,以期為L-薄荷醇藥理的開發提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L-薄荷醇(純度≥99.5%)、卡馬西平(純度≥99%)、戊四唑(純度≥ 98%) 上海麥克林生化科技有限公司;N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA,純度≥98%) 美國Sigma公司;磷酸緩沖鹽PBS(pH7.2) 上海克隆生物化學制品(北京)有限公司;小鼠γ-氨基丁酸試劑盒、小鼠谷氨酸試劑盒 南京建成生物公司;雄性ICR小鼠,體重18～22 g 由長春市億斯實驗動物科技有限公司提供,生產許可證編號:SCXK(2016-0003),小鼠正常自由進食飲水,室溫(25±2) ℃,濕度55%±5%,維持正常晝夜節律。

JA2003J電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;Avanti TM J-3OI冷凍離心機 海南赫敏儀器有限公司;Spectra MAX 190酶標儀 上海美谷分子儀器有限公司;DY89-1電動玻璃勻漿機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 L-薄荷醇對抗戊四唑所致小鼠驚厥實驗 將50只健康雄性小鼠隨機分為5組,每組10只,分別空白組(相同體積的生理鹽水)、陽性組卡馬西平(80 mg/kg),L-薄荷醇高(70 mg/kg)、中(30 mg/kg)、低(8 mg/kg)三個劑量組,連續灌胃給藥3 d,一天一次。于末次給藥60 min后,每組小鼠腹腔注射戊四唑(70 mg/kg)[13],每只小鼠單獨放置籠子里觀察30 min。以全身陣攣性驚厥為觀察指標,以給藥后至出現第一次陣攣發作為驚厥潛伏期,以陣攣性發作出現的時間為驚厥持續時間,觀察記錄30 min內驚厥小鼠的數量、驚厥潛伏期、驚厥持續時間、死亡數量,計算死亡率[14]。

1.2.2 L-薄荷醇對NMDA所致小鼠驚厥實驗 將50只健康雄性小鼠隨機分為5組,每組10只,分別為空白組(相同體積的生理鹽水)、陽性組卡馬西平組(80 mg/kg)、L-薄荷醇高(70 mg/kg)、中(30 mg/kg)、低(8 mg/kg)三個劑量組,連續灌胃給藥3 d,一天一次。于末次給藥30 min后,每組小鼠腹腔注射NMDA(50 mg/kg)[15],每只小鼠單獨放置籠子里觀察30 min。以全身陣攣性驚厥為觀察指標,以給藥后至出現第一次陣攣發作為驚厥潛伏期,以陣攣性發作出現的時間為驚厥持續時間,觀察記錄30 min內驚厥小鼠的數量、驚厥潛伏期、驚厥持續時間、死亡數量,計算死亡率。

1.2.3 GABA與Glu的測定 行為學實驗結束,立即將小鼠斷頭處死,在冰臺上迅速將小鼠腦組織取出,放置于-80 ℃冰箱保存,在測定前,用預冷的生理鹽水沖洗腦組織表面血跡,稱重,加入9倍體積的冰冷的磷酸鹽緩沖溶液PBS(pH7.2),使用勻漿機將腦組織充分勻漿,將組織液置于離心機中4 ℃,12000 r/min離心4 min,取上清液[16]。按照試劑盒說明分別檢測上清液中GABA、Glu含量。

1.3 數據分析

2 結果與分析

2.1 L-薄荷醇對戊四唑所致小鼠驚厥的影響

L-薄荷醇對戊四唑所致驚厥的影響如表1所示,戊四唑可以反映藥物的抗驚厥效果,腹腔注射40～100 mg/kg可誘發驚厥[17],與空白對照組比較L-薄荷醇高劑量組(70 mg/kg)可極顯著縮短戊四唑所致小鼠驚厥持續時間(p<0.01),使驚厥潛伏期極顯著延長(p<0.01),使死亡率降低到30%,抗驚厥效果優于陽性藥卡馬西平。L-薄荷醇中劑量組(30 mg/kg)與空白對照組比較可顯著縮短驚厥持續時間(p<0.05),延長驚厥潛伏期(p<0.05),減少戊四唑所致驚厥數,使死亡率降低到50%;但L-薄荷醇的低劑量組(8 mg/kg)對戊四唑所致驚厥無抑制效果,對驚厥數量、驚厥潛伏期、驚厥持續時間、死亡率均無顯著性影響。實驗結果顯示L-薄荷醇可抑制戊四唑所致驚厥,且呈一定的劑量依懶性,低劑量的L-薄荷醇對驚厥的發作無明顯的抑制作用。戊四唑是通過GABA受體介導引起驚厥,中樞神經系統GABA含量變化與驚厥密不可分。有研究表明L-薄荷醇通過增強GABA能緊張性抑制下調中樞神經元的興奮性,可以抑制大鼠電刺激所產生的癲癇發作[18]。L-薄荷醇可能是作用于GABA能系統抑制戊四唑誘導的驚厥。

表1 L-薄荷醇對戊四唑所致小鼠驚厥的影響(x±s,n=10)

2.2 L-薄荷醇對NMDA所致小鼠驚厥的影響

如表2所示,與空白對照組比較,L-薄荷醇高劑量組(70 mg/kg)可極顯著縮短NMDA所致小鼠驚厥持續時間(p<0.01),使死亡率降低至20%,使驚厥潛伏期延長(p<0.01)。L-薄荷醇中劑量組(30 mg/kg)與空白對照組比較可顯著縮短驚厥持續時間(p<0.05),延長驚厥潛伏期(p<0.05),降低死亡率至40%,但對NMDA所致驚厥數無影響。L-薄荷醇的低劑量組(8 mg/kg)對NMDA所致驚厥無抑制效果,對驚厥數量、驚厥潛伏期、驚厥持續時間、死亡率均無影響。驚厥發作的機理表明[19],興奮性氨基酸谷氨酸與神經元異常興奮密切相關,NMDA是一種強力外源性致驚劑,作用于谷氨酸NMDA受體,通過阻斷NMDA谷氨酸型受體介導的突觸興奮可以抑制驚厥發作。腹腔注射50 mg/kg的NMDA即可誘發驚厥,L-薄荷醇高劑量組(70 mg/kg)與中劑量組(30 mg/kg)對NMDA表現出的抗驚厥效果可能是通過作用于谷氨酸能系統。

2.3 L-薄荷醇對戊四唑所致驚厥小鼠腦內GABA含量的影響

如圖1,L-薄荷醇的高劑量組(70 mg/kg)小鼠腦組織中GABA含量與空白對照組比較明顯升高,具有極顯著差異(p<0.01)。L-薄荷醇中劑量組(30 mg/kg)小鼠腦組織中GABA含量與空白對照組比較具有顯著差異(p<0.05),L-薄荷醇的高劑量和中劑量組可以拮抗戊四唑所致小鼠腦內GABA含量的降低。但L-薄荷醇的低劑量組(8 mg/kg)小鼠腦組織中GABA含量與空白組比較無差異性。腦組織中GABA含量降低是神經細胞過度興奮,過度放電,誘發驚厥的主要原因之一[20]。實驗通過對GABA含量的檢測,數據結果表明,與空白組比較,L-薄荷醇高劑量(70 mg/kg)與中劑量(30 mg/kg)能增加小鼠腦中GABA的含量,其差異性具有統計學意義。證實L-薄荷醇通過作用在γ-氨基丁酸能系統,拮抗戊四唑誘導驚厥發生。

圖1 L-薄荷醇各劑量組對戊四唑所致驚厥小鼠腦內GABA含量的影響

2.4 L-薄荷醇對NMDA所致驚厥小鼠腦內Glu含量的影響

如圖2,L-薄荷醇的高劑量組(70 mg/kg)小鼠腦組織中Glu含量與空白對照組比較明顯降低,具有極顯著差異(p<0.01)。L-薄荷醇中劑量組(30 mg/kg)小鼠腦組織中Glu含量與空白對照組比較具有顯著差異(p<0.05),L-薄荷醇的高劑量和中劑量組可以拮抗NMDA所致小鼠腦內Glu含量的升高。但L-薄荷醇的低劑量組(8 mg/kg)小鼠腦組織中Glu含量與空白組比較無差異性。腹腔注射NMDA可增加抑制性氨基酸谷氨酸的含量,誘發驚厥,L-薄荷醇的高劑量組(70 mg/kg),中劑量組(30 mg/kg)極顯著(p<0.01)的降低了腦組織中Glu水平,與行為學表現相一致,減低NMDA所致驚厥死亡率,延長驚厥潛伏期,縮短驚厥持續時間,降低驚厥發生次數。

圖2 L-薄荷醇各劑量組對NMDA所致驚厥小鼠腦內Glu含量的影響

3 討論

戊四唑模型是常用的篩選藥物抗驚厥作用的方法,戊四唑是GABA受體拮抗劑,通過抑制GABA神經遞質引起驚厥[21]。GABA是大腦中樞神經系統中的主要抑制性受體[22],直接和間接地參與大多數腦疾病,包括焦慮障礙、睡眠障礙、情緒障礙、認知障礙、精神分裂癥和癲癇癥,GABA含量的降低與驚厥有著密不可分的關系[23]。L-薄荷醇高劑量(70 mg/kg)、中劑量組(30 mg/kg)可扭轉由戊四唑所致GABA含量的降低,有效地抑制驚厥發生數量,縮短驚厥持續時間,減少驚厥死亡率。

谷氨酸是中樞神經系統內興奮性神經遞質,驚厥發生多數是由于興奮和抑制作用失衡所致,當興奮因素占明顯優勢時可誘發癲癇[24]。NMDA是谷氨酸激動劑,系統的腹腔或腦室內給藥均可誘發鼠類的運動性癲癇發作[25]。動物實驗表明,應用NMDA拮抗劑可抑制癲癇發作,證實驚厥發作與NMDA或其受體的表達有關[26],本實驗使用NMDA致驚厥模型評估了L-薄荷醇高劑量(70 mg/kg)、中劑量組(30 mg/kg)和低劑量組(8 mg/kg)抗驚厥效果,實驗結果表明L-薄荷醇高劑量(70 mg/kg)、中劑量組(30 mg/kg)可扭轉由NMDA所致Glu含量的升高,有效地抑制驚厥發生數量,縮短驚厥持續時間,減少驚厥死亡率。

4 結論

本實驗研究了L-薄荷醇的抗驚厥效果及其發揮抗驚厥作用的相關機制。采用戊四唑、NMDA致驚厥模型,評估L-薄荷醇的抗驚厥效果,結果顯示L-薄荷醇高(70 mg/kg)、中(30 mg/kg)劑量組能對抗戊四唑和NMDA所致的驚厥,有效地抑制驚厥發生數量,縮短驚厥持續時間,延長驚厥潛伏期,降低驚厥死亡率。但低劑量組(8 mg/kg)并未顯示出抗驚厥效果,可能是L-薄荷醇抗驚厥作用存在劑量依懶性。中樞神經系統中興奮性氨基酸與抑制性氨基酸存在動態平衡,共同調節神經元活動,驚厥的發作與其含量變化極為相關[27-28]。本文通過對驚厥小鼠腦組織中GABA與Glu含量的測定證實L-薄荷醇抗驚厥的作用機制可能與對γ-氨基丁酸系統能和谷氨酸系統能神經系統的調節相關。該研究的成果將為L-薄荷醇藥理的開發提供一定的理論基礎。有關其成藥性、深入的作用機理將在后續實驗中開展研究。