鎘對中華圓田螺抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化的影響

周妍英,羅正明

(1.忻州師范學(xué)院生物系,山西忻州 034000;2.山西大學(xué)黃土高原研究所,山西太原 030006;3.忻州師范學(xué)院地理系,山西忻州 034000)

鎘在工、農(nóng)業(yè)中的廣泛應(yīng)用對水生生態(tài)系統(tǒng)造成了嚴重破壞。目前,鎘已被公認為水體中主要的重金屬污染物之一[1]。研究表明,鎘會對水生動物的鰓、肝臟、腎臟和性腺等器官造成損害,進而影響其生長、代謝、生殖及免疫等重要生理功能[2-7]。鎘在水生生物體中的富集,會通過食物鏈傳遞效應(yīng)進入人體,富集在人體的組織器官中。由于鎘具有高毒性、半衰期長和難降解等特點,一旦進入人體,就會嚴重影響著人體健康[8-10]。

研究表明,鎘能引起機體的氧化應(yīng)激反應(yīng),誘導(dǎo)機體產(chǎn)生活性氧自由基(Reactive Oxygen Species,ROS)。在正常情況下,生物體自身由抗氧化系統(tǒng)來維持體內(nèi)的氧化-還原平衡。當(dāng)機體處于脅迫狀態(tài)時,體內(nèi)的抗氧化酶(超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)等)會發(fā)揮作用來調(diào)控ROS水平[11],以維持動態(tài)平衡。機體的抗氧化系統(tǒng)遭到抑制或破壞時,ROS會不斷堆積,對細胞或組織造成毒性損害。研究表明,ROS會攻擊細胞膜上的脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),進而產(chǎn)生丙二醛(MDA),引起氧化損傷反應(yīng)[12-13],MDA可作為檢測脂質(zhì)過氧化程度的常用指標。因此,研究污染物影響下抗氧化酶活性的變化規(guī)律和氧化損傷程度,探索其致毒機理,引起了學(xué)者們的重視。

田螺在水中活動空間小,對重金屬污染有一定的耐受性,能真實地反映周圍水和底泥的實際污染狀況,是一種理想的生物指示物種。中華圓田螺(Cipangopaludinacathayensis)是淡水腹足類中的優(yōu)勢種群,也是我國湖泊、河流、水庫及稻田等淡水水域中一種主要的大型底棲軟體動物[14],在水生生態(tài)系統(tǒng)中起著重要的作用。郭明新等[15]以中華圓田螺為實驗材料研究發(fā)現(xiàn),中華圓田螺是一種理想的底泥重金屬毒性的指示物種。鑒于此,本研究以中華圓田螺為實驗材料,研究了鎘對其肝胰腺組織中抗氧化酶(CAT、SOD、GPx和GST)活性、谷胱甘肽(GSH)和氧化損傷指標MDA含量的影響,為水環(huán)境重金屬污染的控制及生態(tài)風(fēng)險評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中華圓田螺 山東省濟寧市微山縣微山湖;CdCl2·2.5H2O、Na2HPO4、KH2PO4等 天津市博迪化工廠;SOD、GPx、CAT、GSH、GST、MDA和蛋白質(zhì)含量等檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所。

Thermo MR23冷凍離心機、-80 ℃超低溫冰箱 日本Thermo公司;SpectraMaxM5多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司;電子分析天平 上海菁海儀器有限公司;電動勻漿器 美國Pro Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設(shè)計 依據(jù)我國漁業(yè)水質(zhì)標準[16],設(shè)置4個Cd2+染毒濃度(1.5、3.0、6.0、12.0 mg/L)和1個空白對照組(不染毒組)。中華圓田螺在實驗室水族缸中暫養(yǎng)20 d以上,養(yǎng)殖水條件為:循環(huán)水族缸中水溫(20～25 ℃)和pH(7.5左右)。暫養(yǎng)結(jié)束后,隨機選取個體大小相近、健康的120只田螺進行染毒,空白組放置20只個體,每個染毒組放置25只個體,處理時間為24、48、72和96 h。染毒期間水質(zhì)條件同暫養(yǎng)期間的水質(zhì)條件,染毒期間不喂食、不換水。

1.2.2 樣品制備 染毒結(jié)束后,隨機從每個染毒缸中取出5只田螺置于冰上解剖,去殼、迅速取出肝胰腺,稱重放入離心管中,-80 ℃冰箱保存待用。

1.2.3 指標檢測 將所得肝胰腺組織按1∶10 (g/mL)的比例加入預(yù)冷的磷酸緩沖液PBS(0.01 mol/L,pH7.8),勻漿并離心(12000 r/min,10 min,4 ℃),取上清液測定各種生化指標。SOD、CAT、GPx、GST、GSH活性及MDA和蛋白質(zhì)含量的測定均依據(jù)試劑盒說明書中的步驟測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件,檢驗實驗數(shù)據(jù)的正態(tài)分布性,采用單因素方差分析法(One-WayANOVA)中的Duncan法進行多組樣本間差異顯著性,且p<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘對中華圓田螺肝胰腺組織中SOD活性的影響

由圖1可知,隨著Cd2+濃度的增加和暴露時間的延長,中華圓田螺肝胰腺組織中SOD的活性表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢。與對照組相比,3個Cd2+處理組(24 h、6.0 mg/L,48 h、3.0 mg/L和72 h,3.0 mg/L)肝胰腺中SOD活性最高,當(dāng)Cd2+暴露時間延長至96 h,隨著Cd2+濃度增加,SOD 活力均出現(xiàn)下降趨勢(p<0.05),且在濃度為12.0 mg/L時活性降至最低。

圖1 Cd2+對中華圓田螺肝胰腺組織中SOD活性的影響

2.2 鎘對中華圓田螺肝胰腺組織中CAT活性的影響

由圖2可知,隨著暴露時間的延長,同一濃度組不同處理時間中華圓田螺肝胰腺組織中的CAT活性表現(xiàn)為先升后降的趨勢。同一暴露時間作用下,隨著Cd2+濃度的增加,肝胰腺中CAT活性也表現(xiàn)為先升后降的趨勢。與對照組相比,每個時間段(24 h、6.0 mg/L,48 h、3.0 mg/L濃度組,72 h、1.5 mg/L和96 h、1.5 mg/L)肝胰腺組織中CAT活性,均顯著升高(p<0.05)。當(dāng)時間延長到96 h時,與對照組比較,1.5 mg/L濃度組顯著升高(p<0.05),6.0和12.0 mg/L濃度組顯著降低(p<0.05)。

圖2 Cd2+對中華圓田螺肝胰腺中CAT活性的影響

2.3 鎘對中華圓田螺肝胰腺組織中GPx活性的影響

由圖3可知,隨著Cd2+濃度的升高,在短時間內(nèi)(24、48 h),中華圓田螺肝胰腺GPx活性先升高后下降,在Cd2+濃度為3.0 mg/L和1.5 mg/L時GPx活性達到最高值,與對照組有顯著差異(p<0.05)。暴露時間為72、96 h時,GPx活性一直呈現(xiàn)下降的趨勢,在Cd2+濃度為12.0 mg/L活性GPx降至最低。除1.5 mg/L濃度組的GPx活性隨時間的延長呈先升后降的趨勢,其余濃度組的GPx活性均隨著時間的延長而降低。

圖3 Cd2+對中華圓田螺肝胰腺組織中GPx活性的影響

2.4 鎘對中華圓田螺肝胰腺組織中GST活性的影響

由圖4可知,隨著Cd2+濃度的增加,中華圓田螺肝胰腺組織中GST活性表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢。除高濃度組(12.0 mg/L)的GST活性隨時間的延長呈下降的趨勢,其余濃度組的GST活性均隨著時間的延長呈先升后降的趨勢。與對照組相比,四個處理組當(dāng)Cd2+暴露24 h、1.5 mg/L,48 h、3.0 mg/L,72 h、1.5 mg/L,96 h、1.5 mg/L時,GST活力最高。暴露時間為24 h時,隨著Cd2+濃度的增加,與對照組相比,1.5 mg/L時GST活力顯著升高(p<0.05),達到最大值,然后開始下降,6.0 mg/L時GST活性回到正常水平。

圖4 Cd2+對中華圓田螺肝胰腺GST活性的影響

2.5 鎘對中華圓田螺肝胰腺組織中GSH含量的影響

由圖5可知,隨著Cd2+濃度的增加,中華圓田螺肝胰腺中GSH含量均呈先升后降的趨勢。低濃度Cd2+(1.5 mg/L)對中華圓田螺肝胰腺組織中的GSH水平無顯著影響(p>0.05),中濃度Cd2+(3.0、6.0 mg/L)導(dǎo)致肝胰腺組織中的GSH水平顯著升高(p<0.05),高濃度Cd2+(12.0 mg/L)時,與低、中濃度Cd2+(3.0、6.0 mg/L)相比,48 h和96 h兩個時間段肝胰腺組織中的GSH含量顯著降低(p<0.05)。1.5、6.0和12.0 mg/L濃度組,GSH含量隨著時間的延長基本呈先升后降的趨勢,與對照組相比,1.5 mg/L濃度組每個時間段的GSH含量均無顯著差異(p>0.05),6.0 mg/L濃度組均顯著升高(p<0.05)。

圖5 Cd2+對中華圓田螺肝胰腺組織中GSH含量的影響

2.6 鎘對中華圓田螺肝胰腺組織中MDA含量的影響

隨著Cd2+濃度的升高和暴露時間的延長,中華圓田螺肝胰腺組織中MDA水平均呈逐漸升高的趨勢(圖6)。除了低濃度(1.5 mg/L)Cd2+組,其它濃度組肝胰腺組織中MDA含量顯著高于對照組(p<0.05)。與對照組相比,當(dāng)Cd2+濃度為12.0 mg/L時,各時間段MDA含量均升至最高水平,并在96 h達到峰值。

圖6 Cd2+對中華圓田螺肝胰腺組織中MDA含量的影響

3 討論

水生動物的肝胰腺組織不僅是各種生物大分子代謝和儲存的重要場所,而且在解毒方面發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn),肝胰腺是水生動物鎘蓄積的主要器官[3,17],也是鎘毒性作用的主要靶器官之一。在正常情況下,生物體中活性自由基(ROS)的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)。為維持ROS的動態(tài)平衡狀態(tài),生物體自身形成了一套抗氧化系統(tǒng),分為兩類:一類是抗氧化酶,如:SOD、GPx和CAT等,這些酶能清除機體中過量的ROS,從而減少外界脅迫物對機體造成的氧化損傷[11,18-19];而另一類是抗氧化非酶物質(zhì),GSH作為一種抗氧化非酶物質(zhì),是生物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)中最重要的小分子活性寡肽。作為GPx和GST的作用底物,GSH可以清除生物體內(nèi)的ROS或脂質(zhì)過氧化物,使其轉(zhuǎn)化成脂肪酸和水[20],而GSH被氧化成氧化型谷胱甘肽(GSSG)。如果機體長時間處于脅迫狀態(tài),ROS不能及時清除,會干擾抗氧化系統(tǒng)的正常運轉(zhuǎn)[21-22],進而對機體產(chǎn)生氧化損傷效應(yīng)[23-24]。

據(jù)報道,低濃度鎘暴露下,機體的抗氧化酶活力短時間內(nèi)會升高,而高濃度的鎘會抑制抗氧化酶的活力,對機體造成損害[11]。研究表明,將中華絨螯蟹(Eriochersinensis)暴露于低濃度鎘環(huán)境中,蟹體由于氧化應(yīng)激反應(yīng),其SOD活性會升高,隨著濃度升高,其SOD活性降低[25]。鎘對長江華溪蟹(Sinopotamonyangtsekiense)肝胰腺線粒體中SOD活性的影響有類似的變化趨勢[26]。同時,在本實驗中,鎘會引起中華園田螺肝胰腺組織中SOD的活性發(fā)生變化,即呈現(xiàn)先升后降的趨勢。

CAT廣泛存在于機體中各個組織器官或細胞中,能迅速分解H2O2生成H2O和O2。本實驗發(fā)現(xiàn),鎘可顯著誘導(dǎo)田螺肝胰腺組織中CAT活性升高,隨著鎘濃度增加,CAT 活性開始下降,這與張清順等[27]的研究結(jié)果類似。研究報道,在急性鎘暴露下,斑馬魚(Daniorerio)腦組織中CAT酶的活性會升高[28];急性或者亞慢性鎘暴露下,綠唇貽貝(Pernacanaliculus)鰓、消化腺和血淋巴細胞中CAT活性也會升高[29]。當(dāng)少量的鎘離子進入機體,誘導(dǎo)機體產(chǎn)生ROS,這時,CAT活性升高來分解H2O2。然而隨著機體內(nèi)鎘離子濃度的升高,ROS過多堆積,CAT的合成過程被阻[12,26],從而導(dǎo)致其活性下降。

GPx是在GST的催化作用下,清除機體內(nèi)H2O2、·OH等自由基的含量[30]。本實驗結(jié)果顯示,田螺肝胰腺中GPx活力呈先升后降趨勢,這與SOD和CAT兩種抗氧化酶活性變化趨勢一致。究其原因,可能是鎘離子可以與GPx的活性中心(Se-Cys)結(jié)合[26],一方面降低了鎘對機體造成的損傷,另一方面導(dǎo)致其活性部位構(gòu)象發(fā)生改變,進而抑制其活性。GST是機體重要的抗氧化酶之一,廣泛分布于各種組織細胞與血液中,GSH是生物體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì),在GPx和GST的催化作用下,可以還原ROS生成水,而GSH本身被氧化成GSSH[31]。有研究發(fā)現(xiàn),隨著鎘處理時間的延長,在48、72、96 h時,背角無齒蚌(Anodontawoodianawoodiana)鰓組織中GST活性被低濃度鎘誘導(dǎo),高濃度鎘作用下,GST活性降低[32],這與本實驗得到的結(jié)果是一致的。抗氧化酶活性變化在整體上表現(xiàn)出“低促高抑”現(xiàn)象,即低濃度鎘暴露時,可誘導(dǎo)機體抗氧化酶活性升高,引發(fā)“毒性興奮效應(yīng)”,而高濃度時,則會使抑制抗氧化酶活性。推測其原因可能涉及:a.低濃度鎘誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS,促機體自身的防御系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)答,抗氧化酶活性升高;b.鎘通過與抗氧化酶活性部位的必須金屬元素競爭而結(jié)合在活性中心,改變了酶的空間構(gòu)像,進而使其活性降低;c.隨著鎘暴露濃度的升高或者時間延長,鎘通過耗盡體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)GSH和金屬硫蛋白MT,使抗氧化系統(tǒng)遭到破壞,使抗氧化酶活性降低。

當(dāng)機體長時間暴露在被污染的環(huán)境中,機體自身的抗氧化系統(tǒng)遭到破壞,ROS會大量堆積在機體內(nèi)得不到及時清除,這時,ROS首先會攻擊細胞膜上的脂質(zhì)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)生成MDA。目前,MDA含量被認為是細胞氧化損傷機制的主要標志之一[33]。本實驗結(jié)果顯示,隨著鎘暴露時間延長,濃度的升高,肝胰腺組織中MDA含量也顯著升高,這樣的結(jié)果也有類似的報道[13,21]。原因可能有兩方面:一方面,鎘會間接誘導(dǎo)機體產(chǎn)生ROS從而攻擊細胞膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)[11],進而產(chǎn)生MDA;另一方面,在長時間高濃度鎘暴露下,機體中的抗氧化酶活力被抑制[12],從而清除自由基的能力下降,引起MDA含量升高,最終對機體產(chǎn)生氧化損傷。

4 結(jié)論

鎘暴露引起中華圓田螺肝胰腺組織抗氧化酶活性的變化出現(xiàn)“低促高抑”現(xiàn)象,隨著鎘濃度增加和暴露時間的延長,中華圓田螺肝胰腺組織中的MDA含量呈持續(xù)升高趨勢,中華圓田螺的抗氧化酶系統(tǒng)受到鎘的破壞,進而引起了氧化損傷效應(yīng)。抗氧化酶活性和MDA含量的變化均可以靈敏反映鎘對水生生物肝胰腺組織的脅迫程度,可以作為水環(huán)境重金屬毒性效應(yīng)機理研究的評估指標。總之,中華圓田螺可作為監(jiān)測水環(huán)境重金屬污染的一種指示生物物種。